上海酶联生物PCR试剂盒实验的注意事项，我司作为一家立志【zhì】于为人类生命健康【kāng】事业贡献力量的【de】试【shì】剂生产型企业，产品名【míng】称依旧“不【bú】忘【wàng】初心、胸怀大爱"，以【yǐ】守护节能、健康的环境【jìng】为己【jǐ】任！

PCR实验要注意以下几点：

1. PCR引物设计：

引【yǐn】物设计可能是PCR扩【kuò】增成功zui关【guān】键的因素。如引物设计欠佳，可能导【dǎo】致扩增产【chǎn】物不足，甚至扩增失【shī】败，其原【yuán】因是设计欠佳的引物【wù】可导【dǎo】致非特异扩增和【hé】/或形成引物二聚体，此又【yòu】成【chéng】为【wéi】PCR反应的竞争性【xìng】产物，从而进一步【bù】抑【yì】制PCR产【chǎn】物形成。

在引【yǐn】物设计时【shí】必【bì】须考虑以下几个因素，其中zui重要的【de】是引物【wù】长度、溶解温度（Tm）、特异性、引物【wù】序列【liè】互补问题、G/C 含量【liàng】和多嘧啶（T,C） 或多嘌呤（A, G）延伸【shēn】、3’-末端序【xù】列等【děng】。 

（1）引物长【zhǎng】度：由于PCR反【fǎn】应【yīng】的特异性、退火【huǒ】温【wēn】度以及时间均【jun1】至少部分与PCR引物长度相关联，因此引【yǐn】物【wù】长度是PCR扩增是【shì】否成功【gōng】关键的因素【sù】。一【yī】般【bān】PCR引物长度为9-21核苷酸。

（2）溶解温度（Tm）：因加热而【ér】断开H键，使双链DNA分开【kāi】或“溶解【jiě】"为单链DNA。溶【róng】解温度（Tm）即【jí】指使一半双链【liàn】DNA变为单链DNA的温【wēn】度。Tm可采【cǎi】用下列公【gōng】式【shì】计算：Tm＝2（A+T） + 4（G+C）。

需注意PCR反应至少有两个（一对）引物，两个寡【guǎ】核【hé】苷酸引物Tm 值应比【bǐ】较接近，不【bú】可差异过大。因有【yǒu】较高【gāo】的Tm值【zhí】的引物在较低的反【fǎn】应温度【dù】时可发生错【cuò】配，而【ér】引物【wù】Tm值较低，反【fǎn】应【yīng】温度较【jiào】高时则可能不能发生作【zuò】用【yòng】，因此如【rú】引物的【de】Tm值差异较【jiào】大，可导致PCR扩增效【xiào】率低下甚至扩增失败。

（3）引物序列【liè】互补：设计【jì】引物时应没有3个碱基以上的【de】内【nèi】引物配【pèi】对，如引物有这【zhè】样具有自我配对的区【qū】域【yù】，“弹回"即【jí】部分双链结构将发生在退【tuì】火反应【yīng】时。

（4）G/C 含【hán】量和多嘧啶（T,C） 或多嘌呤（A, G）延伸【shēn】：待选择的引物序【xù】列应尽可【kě】能是碱基随【suí】意分布【bù】，G+C含量平均-避免长A+T和富含G+C的区域。在【zài】引【yǐn】物的碱基组成中GC含【hán】量【liàng】一般为45％-55％。在选【xuǎn】择的引物序【xù】列中应【yīng】没【méi】有【yǒu】多G 或【huò】多C延【yán】伸，因其可促进【jìn】非特异性【xìng】退火【huǒ】，多A 和多T延【yán】伸也应避免，因其可“呼【hū】吸"和使引物【wù】－模板复合物展开延伸，降低扩增【zēng】的效【xiào】率。同时多【duō】嘧【mì】啶（T,C）和多嘌呤（A,G）延伸也应被避免。 

（5）3’-末端【duān】序列：为控制【zhì】引物错【cuò】配，应认真地确定PCR引物【wù】中3’末端的位【wèi】置。

总而言之，应【yīng】重【chóng】视PCR引【yǐn】物设计，设计PCR引【yǐn】物时应认真小【xiǎo】心。对于一【yī】个成功【gōng】的【de】PCR来说，几个重要因【yīn】素如引物长度、GC含量和3’序列必须优化【huà】。理想【xiǎng】的引【yǐn】物应为【wéi】差不多随意分布的【de】核苷酸混合【hé】、GC含量50％、长度【dù】约为20个碱基，因【yīn】此能使Tm值【zhí】处于9-21ºC范围。分析靶基【jī】因【yīn】潜在引物【wù】位点【diǎn】时，应【yīng】考虑【lǜ】无单聚合【hé】体, 没有明显的二级结构形成的倾【qīng】向，不自我互补，与【yǔ】其【qí】他双链靶基因序列没有明显的同源性。为避免枯燥无味【wèi】的设计，节省时间，减少错【cuò】误，可【kě】应用计算机程序优化【huà】设计、选择、确定寡核苷酸【suān】引物【wù】。

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