细【xì】胞冻存及复苏的基本原则是慢冻【dòng】快融，实验证【zhèng】明【míng】这样可以大限度的保存细胞活【huó】力【lì】。目前细【xì】胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这【zhè】两种物质能提高细胞膜对水的通【tōng】透性，加【jiā】上缓慢冷冻可使【shǐ】细【xì】胞内的水分渗【shèn】出细胞外，减【jiǎn】少细胞内冰晶【jīng】的形成，从而减少由于冰晶形成【chéng】造成的【de】细胞损伤【shāng】。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样【yàng】可以【yǐ】保【bǎo】证细【xì】胞外结晶在很短的时【shí】间【jiān】内即融化【huà】，避免由于缓【huǎn】慢融化使水分渗入细胞内形【xíng】成胞内再【zài】结晶对细胞【bāo】造成损伤。细胞【bāo】复苏【sū】是一【yī】简单的试验操【cāo】作，但操作中有【yǒu】许多需要【yào】注意【yì】的事项，在实验操作中【zhōng】注意细小【xiǎo】问题，才【cái】能使复【fù】苏后的【de】细胞状态保持【chí】良好，针对【duì】细胞复苏，1. 可以【yǐ】提前把需要的体积的培养液【yè】放到培养瓶【píng】里，拧松瓶盖，放到孵箱里半小时到【dào】1小时【shí】； 2. 为防止冻存管在升温【wēn】时爆【bào】裂【liè】等，可以【yǐ】在放入水浴前【qián】就实现在超净【jìng】台里把盖子拧【nǐng】松一下【xià】然后再拧上【shàng】； 3. 水浴温【wēn】度【dù】40℃应该也没【méi】问题，但正规的protocol上从来都【dōu】只说37℃。
一、冻存和复苏的原则：慢冻快融
当细胞冷到零度【dù】以下【xià】，可【kě】以产生以下变化：细胞【bāo】器脱【tuō】水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在【zài】细【xì】胞内【nèi】形成冰晶。
如果缓慢【màn】冷【lěng】冻，可【kě】使细【xì】胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰【bīng】晶；相【xiàng】反，结晶就大，大【dà】结晶会造成细胞膜【mó】、纲胞器【qì】的损伤和破裂。复苏过程应快融【róng】，目的是防【fáng】止【zhǐ】小【xiǎo】冰晶形成大【dà】冰晶，即冰晶的【de】重结晶。
二、慢冻程序
1.  标准程序：采用细胞冻存器
当温度在-25 ℃以上时，  1~2 ℃/min；
当温度达-25 ℃以下时， 5~10 ℃/min；
当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。
2.  简易程序：将冷冻管【guǎn】（管口【kǒu】要朝上）放【fàng】入【rù】纱布袋内【nèi】，纱布袋系以线绳，通过线绳将【jiāng】纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分【fèn】钟温度下降1~2 ℃的速【sù】度，在40 min内降【jiàng】至液氮表【biǎo】面过【guò】夜，次晨【chén】投【tóu】人液氮中。
3.  传统程【chéng】序：冷冻管【guǎn】置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30 分钟→ -80℃ 16~18 小【xiǎo】时（或隔夜） → 液氮槽长期储存。
三、低温保护剂的应用
在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。
常用的低温【wēn】保护剂是DMSO，它【tā】是一【yī】种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高【gāo】胞【bāo】膜对水的通透性，降低冰【bīng】点，延缓冻结过程，能使细胞【bāo】内水分【fèn】在冻【dòng】结【jié】前【qián】透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内【nèi】冰晶，从而减少冰晶对细胞【bāo】的【de】损伤【shāng】。
四、细胞冻存方法
1.  预先配制冻存液
（1）10%DMSO + 细【xì】胞生长液（20%血清【qīng】+基础培养液）
（2）10%甘油+ 细胞生长液（20%血清+基础培养液）
2.  取对数生【shēng】长期【qī】细胞，经胰酶【méi】消化【huà】后，加入适量冻存液， 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ~ 5 ×106细【xì】胞/ml）。
3.  加入1 ml细胞于冻存【cún】管中【zhōng】，密封后标记【jì】冷冻细胞名【míng】称【chēng】和冷冻日期【qī】。液氮长期保存。
五、保存细胞的复苏方法
1.  快速解冻
冻存细胞从液【yè】氮中取出【chū】后，立【lì】即放入37℃水浴【yù】中，轻轻【qīng】摇动冷【lěng】冻管，使其在1 分钟内全【quán】部【bù】融化（不要超过3 分钟）。
2.  解冻后的【de】细【xì】胞【bāo】可直【zhí】接接种到含*生【shēng】长培养液的细【xì】胞培养【yǎng】瓶中直接进行培【péi】养，24小时后再用新鲜*培养液替换旧【jiù】培养液，以去除DMSO。
3.  如果细胞对冷冻保护剂特别敏感
解冻后的细胞【bāo】应先【xiān】通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种【zhǒng】到含【hán】*生长【zhǎng】培养【yǎng】液的培养【yǎng】瓶中。