本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒用于【yú】体外定量检测血清、血浆、组【zǔ】织匀浆及【jí】相【xiàng】关液【yè】体【tǐ】样本中大【dà】鼠血管内皮【pí】生长因子A(VEGFA)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-20℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经【jīng】过大量正常标本检验【yàn】，标【biāo】本的正常浓【nóng】度值均在试剂【jì】盒【hé】提【tí】供的检测范围内，实验过程中直【zhí】接取50μL样本上样【yàng】即可。当有部分【fèn】样本值【zhí】超过标准品【pǐn】浓度时，可【kě】用样本稀释液将标【biāo】本进行适当稀释后再进行实【shí】验。

检测前准备工作：

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从冰【bīng】箱【xiāng】中取出【chū】的浓缩洗涤液可能【néng】有结晶，属于正常现【xiàn】象；放置室温，轻摇均匀，待结晶【jīng】溶解后再配置【zhì】洗涤液。可【kě】将20ml浓缩洗涤液用【yòng】蒸馏【liú】水或去离子【zǐ】水稀释配【pèi】置【zhì】成400ml工【gōng】作浓度的【de】洗涤液，未用完的放回4℃

3. 20×洗涤缓【huǎn】冲液的【de】稀释：蒸【zhēng】馏【liú】水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加【jiā】19份【fèn】蒸馏水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠【shǔ】血【xuè】管内【nèi】皮生【shēng】长因子A(VEGFA)捕获抗体的包被微孔中，依【yī】次【cì】加入标本【běn】、标准品、HRP标【biāo】记的检测抗体，经过温育洗涤。用【yòng】底物TMB显色，TMB在【zài】过氧化物酶的催化【huà】下【xià】转化成蓝色，并在酸【suān】的作用下转化成黄色。颜色的深浅和样品中的【de】大鼠血【xuè】管内皮【pí】生长因子【zǐ】A(VEGFA)呈正相关【guān】。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值【zhí】），计算样【yàng】品浓度。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过【guò】夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即【jí】可，或将上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应避免【miǎn】反【fǎn】复冻融。

2. 血浆：用EDTA或肝素作【zuò】为抗凝剂采集标本，并将【jiāng】标本在采集后的30分钟内于9-20℃ 1000×g离心15分钟，取【qǔ】上【shàng】清【qīng】即【jí】可【kě】检测，或将上清置于【yú】-20℃或【huò】-80℃保存，但应避【bì】免反复冻融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗【xǐ】组织，去除残【cán】留血液（匀浆中裂解的红细胞会影【yǐng】响测量结果），称【chēng】重后将组织【zhī】剪碎。将剪碎的组织【zhī】与对应体积的PBS（一般按【àn】1:9的重量体积比，比如1g的【de】组织样【yàng】品对应【yīng】9mL的【de】PBS，具体体积可【kě】根据【jù】实【shí】验需要适当调整，并做【zuò】好记录。推荐在【zài】PBS中【zhōng】加【jiā】入蛋白【bái】酶抑制剂）加入玻【bō】璃匀浆器中，于冰上充分【fèn】研磨。为了进一步裂解【jiě】组织细胞，可以【yǐ】对【duì】匀浆【jiāng】液进行超【chāo】声破碎，或【huò】反复冻【dòng】融【róng】。将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或【huò】将【jiāng】上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应避免【miǎn】反复冻【dòng】融。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内【nèi】进【jìn】行【háng】检【jiǎn】测的可保【bǎo】存于4℃，若不能及时检测【cè】，请【qǐng】按【àn】一次使用量分装，冻存于【yú】-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血【xuè】会影响【xiǎng】检测结果，因【yīn】此溶血标【biāo】本不宜进行此项检测。

注意事项：

1. 严格【gé】按照规定的时【shí】间和温度进行温育以保证【zhèng】准【zhǔn】确结果【guǒ】。所有【yǒu】试剂都【dōu】必须在使用前达到室【shì】温9-20℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可以【yǐ】导致不准【zhǔn】确的结【jié】果。在加入底物前【qián】确保尽量吸干【gàn】孔内液体。温【wēn】育过程中不【bú】要【yào】让微【wēi】孔干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应【yīng】试剂不能接触漂白溶剂或【huò】漂白溶【róng】剂所【suǒ】散发的强烈气体。任【rèn】何漂白【bái】成分都【dōu】会破【pò】坏试剂盒中【zhōng】反【fǎn】应试剂的生物活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如【rú】果可能传播【bō】疾病，所【suǒ】有的样【yàng】品【pǐn】都应管理好，按照规【guī】定的程序处【chù】理样品和检测装置。

操作步骤：

1．从室温【wēn】平衡60min后【hòu】的铝【lǚ】箔袋中取出所需【xū】板【bǎn】条，剩【shèng】余板条用自封袋密封放回4℃。

2．设置【zhì】标准【zhǔn】品孔和样本孔，标准品【pǐn】孔各加不【bú】同浓度的标准品【pǐn】50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔【kǒng】外，标准品【pǐn】孔和样【yàng】本孔【kǒng】中每【měi】孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用【yòng】封【fēng】板膜封住反应孔，37℃水浴锅【guō】或恒温箱温育【yù】60min。

5．弃【qì】去液体，吸水纸上拍干，每孔加【jiā】满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸【xī】水纸上【shàng】拍【pāi】干，如此【cǐ】重复【fù】洗板5次（也【yě】可用洗板机【jī】洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每【měi】孔【kǒng】加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处【chù】测定各孔【kǒng】的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准【zhǔn】品【pǐn】浓【nóng】度【dù】作【zuò】横坐标，对应OD值作【zuò】纵坐标，绘制出【chū】标准品线性回归曲【qǔ】线，按曲线方程计算各样本浓【nóng】度值。

（此图仅供参考）

性能：
1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为了避【bì】免交叉感【gǎn】染，配置不同浓【nóng】度标准品【pǐn】、上样、加不同试剂都【dōu】需【xū】要更换枪头。另【lìng】外【wài】不同试【shì】剂请分别使用【yòng】不同的移液槽。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混【hún】合后的显色底物在上板前应为【wéi】无色【sè】，请避光保存；假如【rú】微孔板后，将由【yóu】物【wù】色变成不【bú】同深度的蓝色。

5. 终止液上板顺序应同【tóng】显色【sè】底物上【shàng】板顺序一致【zhì】；加入【rù】终止液【yè】后，孔内颜色由蓝变黄；若【ruò】孔内有绿色，则表明孔内液体未混【hún】匀【yún】；请充【chōng】分混【hún】合。

说明：

1. 由于现有条件及【jí】科学技术水平尚【shàng】不能对【duì】所【suǒ】有供货【huò】商提供的所有【yǒu】原料进行全面的鉴定与分析，本产品可能存在一【yī】定的【de】质量【liàng】技术【shù】风险【xiǎn】。

2. 实验结果与试剂的有效性、实验者【zhě】的相关操作以及当时【shí】的实验环境密切相关【guān】，请【qǐng】务【wù】必准【zhǔn】备充足的【de】标本【běn】备份。

3. 不同【tóng】批次【cì】的同一产品可能会有少许【xǔ】差别，如：检测【cè】限、灵敏度以及显色时间等，请依据【jù】试剂盒内说明书【shū】进【jìn】行实验【yàn】操【cāo】作，网站电子版【bǎn】说明书仅作参考【kǎo】。

4. 只有全部使用本试剂盒【hé】配【pèi】套试剂才能【néng】保证检测效果，不能混用其【qí】他制【zhì】造商的产品。只有严格遵守本试【shì】剂【jì】盒的实验【yàn】说明【míng】才会得到检测结【jié】果。