本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试【shì】剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液【yè】体样本中【zhōng】大鼠中间小电导【dǎo】钙【gài】激【jī】活钾【jiǎ】离【lí】子通【tōng】道亚家族N成员2(KCNN2)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经【jīng】过大量正常标【biāo】本检验，标本【běn】的【de】正常浓度值均【jun1】在【zài】试剂盒提供的检测范围内，实验过【guò】程中直接取50μL样本上样【yàng】即可。当【dāng】有部【bù】分样本值超过标准【zhǔn】品【pǐn】浓度时，可用样本稀释液将标本进行适当【dāng】稀释后再【zài】进【jìn】行【háng】实验。

检测前准备工作：

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从冰【bīng】箱中取出的浓缩洗涤【dí】液可能有【yǒu】结【jié】晶，属于正【zhèng】常现象；放置室温【wēn】，轻摇均匀【yún】，待结【jié】晶溶解后再配置洗涤液。可将20ml浓缩【suō】洗涤液用蒸馏水【shuǐ】或去离子【zǐ】水稀【xī】释配置成400ml工作浓度【dù】的洗涤液【yè】，未用【yòng】完的放回4℃

3. 20×洗【xǐ】涤缓【huǎn】冲液的稀释：蒸馏水按【àn】1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲【chōng】液加19份蒸馏【liú】水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠中间小电导钙激活钾离子通道亚【yà】家族N成员2(KCNN2)捕获抗体的包【bāo】被【bèi】微孔中，依次加入标【biāo】本【běn】、标准品、HRP标记的检测抗体，经过【guò】温育【yù】洗涤。用底物TMB显色，TMB在【zài】过氧化物酶的【de】催化下转化成【chéng】蓝色【sè】，并在酸的作用下转化成黄色。颜【yán】色【sè】的深浅和样【yàng】品【pǐn】中【zhōng】的大鼠中间小电【diàn】导钙【gài】激活钾离子通道亚家族N成员2(KCNN2)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长【zhǎng】下【xià】测【cè】定吸光【guāng】度（OD 值【zhí】），计算【suàn】样品浓度【dù】。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然【rán】后【hòu】1000×g离心20 分【fèn】钟【zhōng】，取【qǔ】上清即可，或【huò】将上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应避免反复冻【dòng】融。

2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝【níng】剂【jì】采集标本，并将标【biāo】本在采集后的30分【fèn】钟内于9-21℃ 1000×g离心15分【fèn】钟，取【qǔ】上【shàng】清即【jí】可检测，或将【jiāng】上清置于-20℃或【huò】-80℃保存，但应避免反复冻融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织【zhī】，去除残留血液【yè】（匀浆中裂【liè】解的红细胞会影响【xiǎng】测【cè】量结果【guǒ】），称重后【hòu】将组织【zhī】剪【jiǎn】碎。将剪碎【suì】的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重【chóng】量体积比，比如1g的组织样【yàng】品对应9mL的PBS，具体体积可根据【jù】实验【yàn】需要适【shì】当【dāng】调【diào】整，并做好记【jì】录。推荐在【zài】PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上【shàng】充分研磨。为了【le】进一步【bù】裂解组【zǔ】织细胞，可以对匀【yún】浆液进行超声破碎，或反复冻融。将【jiāng】匀浆液于5000×g离【lí】心5~10分钟，取上清检【jiǎn】测【cè】。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心【xīn】20分【fèn】钟，取上【shàng】清【qīng】即可检测【cè】，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复【fù】冻融。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内进行检测【cè】的可【kě】保【bǎo】存于4℃，若不能及【jí】时检测【cè】，请【qǐng】按一次使【shǐ】用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测【cè】），或-80℃（6个月【yuè】内检测【cè】），避【bì】免反复冻融，标【biāo】本溶【róng】血会影响检测结果，因此溶血【xuè】标本【běn】不宜进行此项检测。

注意事项：

1. 严格按照规定的【de】时间和温【wēn】度进行温育以保证【zhèng】准确【què】结果。所有【yǒu】试【shì】剂都【dōu】必须在使【shǐ】用前达到室温9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可【kě】以导致不准确的结果。在【zài】加入底物前确保尽【jìn】量【liàng】吸【xī】干孔内液体。温育过程【chéng】中【zhōng】不要让微孔干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何【hé】反应试【shì】剂不能接触漂白溶剂【jì】或漂白【bái】溶剂所散发【fā】的【de】强烈气体。任何漂白成【chéng】分都会破坏试剂盒中反应试【shì】剂的【de】生物活性【xìng】。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果【guǒ】可能传播【bō】疾病，所有的【de】样品都应【yīng】管理好，按【àn】照规定的程【chéng】序处理样品和【hé】检测装置。

操作步骤：

1．从室温平衡60min后的铝【lǚ】箔袋中【zhōng】取出所需【xū】板条，剩余【yú】板【bǎn】条用自封袋密封放回【huí】4℃。

2．设【shè】置标【biāo】准【zhǔn】品孔和【hé】样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准【zhǔn】品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除【chú】空白【bái】孔外，标准【zhǔn】品孔【kǒng】和样本孔中每孔【kǒng】加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体【tǐ】100μL，用封板膜封【fēng】住反应【yīng】孔【kǒng】，37℃水浴锅或恒【héng】温箱温育60min。

5．弃去【qù】液体，吸【xī】水纸上拍【pāi】干，每孔加满洗涤【dí】液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸【zhǐ】上拍干，如此重复洗板5次（也可用【yòng】洗板【bǎn】机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每【měi】孔加【jiā】入终止液50μL，15min内【nèi】，在450nm波长【zhǎng】处测定各孔的【de】OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表【biǎo】中，以标准品浓度作【zuò】横【héng】坐标【biāo】，对应OD值作纵坐标，绘制出【chū】标准品线性【xìng】回归曲线，按【àn】曲线方【fāng】程计算各【gè】样本浓度值。

（此图仅供参考）

性能：
1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为了避免交【jiāo】叉感染，配置不同浓度【dù】标准品、上样、加不同试【shì】剂都需要【yào】更换枪头。另外不【bú】同【tóng】试剂请分别使【shǐ】用不同【tóng】的移液槽。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混合后的显色【sè】底物【wù】在上板前应为无色【sè】，请避光【guāng】保存【cún】；假如微孔板后，将由物【wù】色变成不同【tóng】深度的蓝色。

5. 终止液上板【bǎn】顺序【xù】应同显【xiǎn】色底物上【shàng】板顺序一致；加入终止【zhǐ】液后【hòu】，孔内【nèi】颜色由【yóu】蓝变黄；若孔内有【yǒu】绿色，则表明【míng】孔内液体未混匀；请充分混【hún】合。

说明：

1. 由于现有条件及科学技术水平尚【shàng】不能对所有供货商提供的所有原【yuán】料进行【háng】全【quán】面【miàn】的鉴定【dìng】与分【fèn】析【xī】，本产品可【kě】能存在一定的质量技【jì】术风险。

2. 实验结果与试【shì】剂的有效【xiào】性、实验者的相关操【cāo】作以及当时的实【shí】验环境密切相关，请【qǐng】务必【bì】准备充足【zú】的【de】标本【běn】备份。

3. 不【bú】同批次的同一产品可能【néng】会【huì】有少许差别，如：检测限【xiàn】、灵敏度以及显色【sè】时间等，请【qǐng】依据试剂盒内说明书进【jìn】行【háng】实验操作，网站【zhàn】电子版说明【míng】书仅作参考。

4. 只有全部使用本试剂盒配【pèi】套试剂【jì】才【cái】能保证检测【cè】效果，不能【néng】混用其他制造商的产品。只有【yǒu】严格遵【zūn】守【shǒu】本试剂盒的【de】实验说明才会得【dé】到检测结果【guǒ】。