本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒用【yòng】于体外定量检测血清、血浆、组【zǔ】织匀浆【jiāng】及相关液体样本【běn】中大【dà】鼠组织蛋【dàn】白【bái】酶L(CTSL)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过【guò】大量正常标本【běn】检验，标本的正常【cháng】浓【nóng】度值均在【zài】试剂盒提供的检测范【fàn】围内，实验【yàn】过程【chéng】中直接取50μL样本上样即【jí】可。当有部分样本值超过【guò】标【biāo】准品浓度时，可用样本稀释液【yè】将标本【běn】进行适当稀释【shì】后再进行【háng】实验【yàn】。

 检测前准备工作：

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从冰【bīng】箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正【zhèng】常现象；放【fàng】置室温【wēn】，轻【qīng】摇均【jun1】匀【yún】，待结晶溶【róng】解后再配置洗涤液。可【kě】将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离【lí】子水稀释配置成400ml工作浓度的洗涤液【yè】，未【wèi】用【yòng】完【wán】的放回【huí】4℃

3. 20×洗涤缓冲液的稀【xī】释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤【dí】缓冲液加【jiā】19份蒸【zhēng】馏水【shuǐ】。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠组【zǔ】织蛋白【bái】酶L(CTSL)捕获【huò】抗体的包被微孔中，依【yī】次加入标【biāo】本【běn】、标准品【pǐn】、HRP标记的检测抗体，经过温育洗涤。用【yòng】底物【wù】TMB显色，TMB在【zài】过【guò】氧化物酶的催【cuī】化【huà】下【xià】转化成蓝色，并在酸的作【zuò】用下转化成黄色。颜色【sè】的深浅【qiǎn】和样品中的大鼠组织蛋白酶【méi】L(CTSL)呈正相【xiàng】关。用酶标仪在450nm 波长下测定【dìng】吸光度（OD 值），计算样【yàng】品浓【nóng】度。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或【huò】4℃过【guò】夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置【zhì】于-20℃或-80℃保存，但应【yīng】避免【miǎn】反【fǎn】复冻融。

2. 血浆：用EDTA或肝素【sù】作【zuò】为抗凝剂采集标【biāo】本，并将标本在【zài】采【cǎi】集后的30分钟内于9-21℃ 1000×g离心15分钟，取上清即【jí】可检测，或【huò】将上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应避免反【fǎn】复冻融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组【zǔ】织【zhī】，去除残留【liú】血液（匀浆中裂解的红细胞会影【yǐng】响测量结【jié】果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对【duì】应【yīng】体积【jī】的PBS（一【yī】般按1:9的重量【liàng】体积比，比如1g的组织样【yàng】品对应9mL的PBS，具体体积可根据实【shí】验需要适当【dāng】调整，并做好记【jì】录。推荐在PBS中加入【rù】蛋白酶抑【yì】制剂）加入玻璃匀浆【jiāng】器中，于冰上【shàng】充分研磨。为了进一步裂解【jiě】组【zǔ】织细胞，可以对匀浆液进行超声破【pò】碎，或反复冻融【róng】。将匀浆液于5000×g离【lí】心【xīn】5~10分【fèn】钟，取上清检【jiǎn】测。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取【qǔ】上清【qīng】即可【kě】检测，或将【jiāng】上清【qīng】置于-20℃或-80℃保存【cún】，但应避免反复冻【dòng】融。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可保存【cún】于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分【fèn】装【zhuāng】，冻存于-20℃（1个月【yuè】内检测），或-80℃（6个月内【nèi】检测），避【bì】免反【fǎn】复冻融【róng】，标【biāo】本溶血会【huì】影响检测结【jié】果，因此溶【róng】血标【biāo】本不宜进行此项检测。

注意事项：

1. 严格【gé】按照规定的时间和温度【dù】进行温育以保证【zhèng】准确【què】结果【guǒ】。所有试剂都必须在【zài】使用【yòng】前【qián】达到室温9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不【bú】正确【què】可以导致不准确【què】的结果。在【zài】加入【rù】底物前确保尽量吸干孔内【nèi】液体。温育过程中不要让微孔干【gàn】燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应试【shì】剂不能接触漂白溶剂或漂白溶【róng】剂所【suǒ】散【sàn】发的【de】强烈气体。任何漂白成分都会【huì】破坏试【shì】剂盒中【zhōng】反应试【shì】剂的生物活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如【rú】果可【kě】能【néng】传播疾病，所有【yǒu】的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和【hé】检测装【zhuāng】置【zhì】。

操作步骤：

1．从室温平衡60min后的铝【lǚ】箔袋中取【qǔ】出所需板条，剩余板条用自【zì】封【fēng】袋密封放回4℃。

2．设置【zhì】标准【zhǔn】品【pǐn】孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的【de】标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除【chú】空白【bái】孔【kǒng】外，标准品孔和样本【běn】孔中每【měi】孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板【bǎn】膜封住反应孔，37℃水浴【yù】锅或恒温箱【xiāng】温育【yù】60min。

5．弃【qì】去【qù】液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸【xī】水纸上拍干，如此重【chóng】复洗【xǐ】板5次（也可【kě】用洗【xǐ】板机【jī】洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入【rù】终止液50μL，15min内，在【zài】450nm波【bō】长处测【cè】定各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以【yǐ】标准【zhǔn】品【pǐn】浓度作横坐标【biāo】，对应OD值作纵坐标，绘制出【chū】标准品线性回归曲线，按曲线方【fāng】程【chéng】计【jì】算各样【yàng】本浓度值【zhí】。

（此图仅供参考）

性能：
1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为了避【bì】免交【jiāo】叉感染【rǎn】，配【pèi】置不同浓【nóng】度标准品、上样【yàng】、加不【bú】同试【shì】剂都【dōu】需要更换枪头。另外不同试剂请分别使【shǐ】用不同的移液槽。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混合后的显色底物在上板前应【yīng】为无【wú】色，请避【bì】光保存；假如微孔板后【hòu】，将由物【wù】色【sè】变成不【bú】同深度的蓝色。

5. 终止液上板顺【shùn】序应同显色底物上板顺【shùn】序一致；加入终止液【yè】后【hòu】，孔【kǒng】内颜色由【yóu】蓝变【biàn】黄；若【ruò】孔内有绿色【sè】，则【zé】表明孔内液体未混匀；请【qǐng】充分混合。

说明：

1. 由【yóu】于现有条件【jiàn】及科学【xué】技【jì】术水【shuǐ】平尚不能对所有供货商提【tí】供的所有【yǒu】原料进行全面的鉴定与分析，本产品可能【néng】存在【zài】一定的质量【liàng】技术风险。

2. 实验结【jié】果与试剂【jì】的有效性、实【shí】验者的相关操作以【yǐ】及当时的实验环【huán】境密切相关，请务【wù】必准备【bèi】充足的标本备【bèi】份。

3. 不同批【pī】次的【de】同一【yī】产品可能【néng】会有少许差别，如：检【jiǎn】测限、灵敏度以及显色时间等，请依【yī】据试剂【jì】盒内说明书进行实【shí】验操作，网站【zhàn】电子版说明书仅作【zuò】参【cān】考。

4. 只【zhī】有全部使用【yòng】本试剂【jì】盒配套试剂【jì】才能保证【zhèng】检测效果，不【bú】能混用【yòng】其他制造商的【de】产品。只有【yǒu】严格遵守【shǒu】本试【shì】剂盒的实验说明才会得到检测结果。