本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试【shì】剂【jì】盒【hé】用于体外定量【liàng】检测血清、血【xuè】浆、组织匀【yún】浆及相关液体样本中大鼠Ⅰ 型前胶原氨基端肽(PⅠ NP)PINP的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量【liàng】正常标本检验，标本的正【zhèng】常浓度值均在试剂盒【hé】提供的【de】检测范围内，实【shí】验过程中直接【jiē】取【qǔ】50μL样本上样即可。当有部分样本【běn】值超过标准品浓【nóng】度时，可用样本稀释液将【jiāng】标本【běn】进【jìn】行【háng】适当稀释后再进【jìn】行【háng】实验。

检测前准备工作：

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从冰箱中取出的【de】浓缩洗涤液可能有结晶，属于正【zhèng】常现象；放【fàng】置室温，轻摇均匀，待结【jié】晶溶【róng】解后【hòu】再配置【zhì】洗涤液。可将【jiāng】20ml浓缩洗【xǐ】涤液用蒸【zhēng】馏水或去【qù】离子水稀释配置【zhì】成400ml工作浓度的洗涤【dí】液，未用完的放回【huí】4℃

3. 20×洗涤缓【huǎn】冲液的稀释【shì】：蒸馏水【shuǐ】按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏【liú】水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包【bāo】被大鼠Ⅰ 型前胶原氨基端肽(PⅠ NP)PINP捕获抗体的包被微【wēi】孔中，依次【cì】加入标本、标准【zhǔn】品、HRP标记的检测抗体，经过【guò】温育洗涤。用底【dǐ】物TMB显色，TMB在过【guò】氧化【huà】物酶的催【cuī】化下转【zhuǎn】化成蓝色，并在酸的【de】作【zuò】用下转化【huà】成黄色。颜色的【de】深浅和样品中的大鼠【shǔ】Ⅰ 型前胶原氨基【jī】端肽【tài】(PⅠ NP)PINP呈正相关。用【yòng】酶标仪【yí】在450nm 波【bō】长下测定吸【xī】光度（OD 值），计【jì】算【suàn】样【yàng】品【pǐn】浓度【dù】。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或【huò】4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可【kě】，或将上清置于【yú】-20℃或-80℃保存【cún】，但【dàn】应避免反复冻融。

2. 血浆：用EDTA或【huò】肝素【sù】作为抗凝剂采集标本，并将【jiāng】标本在【zài】采集【jí】后的30分钟内于9-21℃ 1000×g离心【xīn】15分【fèn】钟【zhōng】，取上清【qīng】即可检测，或将上清置于【yú】-20℃或-80℃保存，但【dàn】应避免反复冻融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲【chōng】洗【xǐ】组织，去除残留血液（匀浆中【zhōng】裂解的【de】红细胞会影响【xiǎng】测量结果），称重后【hòu】将组织剪【jiǎn】碎。将剪碎的组织【zhī】与对应体积的【de】PBS（一般按【àn】1:9的重量【liàng】体积比，比如1g的组织样品对应【yīng】9mL的PBS，具体体积【jī】可根据实验需要适当【dāng】调整，并做好【hǎo】记录。推荐在【zài】PBS中加入【rù】蛋白酶抑制剂）加入【rù】玻【bō】璃匀【yún】浆器中，于【yú】冰上充分研磨。为了进一【yī】步裂【liè】解组织【zhī】细【xì】胞，可以对匀【yún】浆液进行超【chāo】声破碎，或反复冻融。将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离【lí】心20分钟，取上清【qīng】即可检测【cè】，或将上清置于【yú】-20℃或-80℃保存【cún】，但应避免反复冻融。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不【bú】能及时检测【cè】，请按【àn】一【yī】次【cì】使用量分装【zhuāng】，冻存于-20℃（1个【gè】月内检测【cè】），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻【dòng】融【róng】，标【biāo】本溶血【xuè】会影响检测结果，因【yīn】此溶血标【biāo】本不【bú】宜进行此项检测。

注意事项：

1. 严【yán】格按照规定的时间和温度进行温育以保【bǎo】证准确结果。所【suǒ】有试剂【jì】都必须在使【shǐ】用【yòng】前达【dá】到室【shì】温9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正【zhèng】确可以导致不【bú】准确的结【jié】果。在加【jiā】入底物【wù】前确保【bǎo】尽量吸干孔内液【yè】体。温育【yù】过程【chéng】中不要让微孔干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应试剂不能接【jiē】触【chù】漂白【bái】溶剂【jì】或漂白溶剂所散发的强烈气【qì】体。任何漂白成分都会【huì】破【pò】坏试【shì】剂盒中反应试剂的【de】生物活【huó】性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果【guǒ】可能【néng】传【chuán】播疾病，所有的样品都应【yīng】管理好，按照规定的【de】程序【xù】处理样品和检测装【zhuāng】置。

操作步骤：

1．从室温平衡60min后的【de】铝【lǚ】箔袋【dài】中取出所需板条，剩【shèng】余板条用自封袋密封放【fàng】回4℃。

2．设置标准品孔【kǒng】和【hé】样本孔，标【biāo】准品孔各加【jiā】不同浓【nóng】度【dù】的标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除【chú】空白孔外，标准品孔和样【yàng】本孔中每孔加【jiā】入辣根【gēn】过【guò】氧化【huà】物【wù】酶（HRP）标记的检测抗【kàng】体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴【yù】锅或恒温【wēn】箱温育60min。

5．弃去【qù】液体，吸水纸上拍干【gàn】，每孔加满洗【xǐ】涤液（350μL），静【jìng】置1min，甩去洗涤液【yè】，吸水【shuǐ】纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用【yòng】洗【xǐ】板机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入终止液【yè】50μL，15min内，在450nm波长处测【cè】定各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标【biāo】准品浓【nóng】度作横坐标，对【duì】应OD值作【zuò】纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线【xiàn】，按曲线方程计算各样本浓【nóng】度值。

（此图仅供参考）

性能：
1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为了【le】避免交叉感染【rǎn】，配置不【bú】同浓度标准品、上样【yàng】、加不同试剂都需要更【gèng】换枪【qiāng】头。另外不同试剂【jì】请分别使用不同的【de】移液槽【cáo】。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混合【hé】后的显色底物在【zài】上板前应为无【wú】色，请避光保存；假如微孔板后，将由物色变成【chéng】不同【tóng】深度的【de】蓝色。

5. 终【zhōng】止【zhǐ】液上板顺【shùn】序应【yīng】同【tóng】显【xiǎn】色底物上板【bǎn】顺序一致；加入终止液【yè】后，孔内颜色由蓝变黄；若孔内【nèi】有【yǒu】绿色，则表明孔内液体未混匀；请充分混合。

说明：

1. 由于【yú】现有条件及科学【xué】技术水【shuǐ】平尚不能对所【suǒ】有供【gòng】货商提供的所有原料【liào】进行全面的鉴定与分【fèn】析，本产【chǎn】品可能存在一定【dìng】的质量技术风险【xiǎn】。

2. 实验结果与试剂的有效性【xìng】、实验者的【de】相关【guān】操作以及当时【shí】的实验环【huán】境密【mì】切【qiē】相关【guān】，请务必准备充足的标本备份。

3. 不【bú】同批次的同一产品可能会有【yǒu】少许差别【bié】，如：检测【cè】限、灵【líng】敏【mǐn】度以及显【xiǎn】色时【shí】间等，请依据【jù】试剂盒内说明书进【jìn】行实验操作，网站【zhàn】电子版说明书仅作参考。

4. 只有全部使用【yòng】本【běn】试剂盒【hé】配套试剂才【cái】能保【bǎo】证【zhèng】检测效果【guǒ】，不能混用其他【tā】制造商的产品。只有严格遵守本试剂盒的实验说【shuō】明才会得【dé】到检测结果。