本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液【yè】体【tǐ】样本中大【dà】鼠组织因子【zǐ】通【tōng】道抑【yì】制因【yīn】子(TFPI)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过【guò】大量正常标本【běn】检验，标【biāo】本的正常【cháng】浓度【dù】值均在【zài】试剂盒【hé】提供的检测【cè】范围内，实验过程中直接取50μL样本上样【yàng】即【jí】可。当有部分样【yàng】本值超过标准【zhǔn】品【pǐn】浓度【dù】时，可用样本稀释【shì】液将【jiāng】标本进行适当稀释后再进行【háng】实验。

检测前准备工作：

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 从冰箱【xiāng】中【zhōng】取出的浓缩洗涤液可【kě】能有结晶【jīng】，属于正常现象；放置室【shì】温，轻摇均匀，待结晶【jīng】溶解后再配置洗【xǐ】涤液。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离【lí】子水稀【xī】释配置成400ml工作浓度【dù】的洗涤液，未用【yòng】完的放【fàng】回4℃

3. 20×洗涤【dí】缓冲液的稀释：蒸【zhēng】馏水按【àn】1：20稀释，即【jí】1份【fèn】20×洗涤缓冲液加19份【fèn】蒸馏水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠组织因子通道抑制因子(TFPI)捕获【huò】抗体的【de】包被【bèi】微孔中，依次【cì】加入【rù】标本、标准品、HRP标记的检测【cè】抗体，经过【guò】温【wēn】育洗涤。用底【dǐ】物TMB显色，TMB在过【guò】氧化物【wù】酶的催化下【xià】转化成蓝色，并【bìng】在【zài】酸的【de】作【zuò】用下转化【huà】成黄【huáng】色【sè】。颜色的深浅【qiǎn】和样品中的【de】大鼠组【zǔ】织因子通道抑制因【yīn】子(TFPI)呈正相【xiàng】关。用酶标仪【yí】在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

实验所需自备试验器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然【rán】后1000×g离心20 分【fèn】钟，取上【shàng】清即可，或将上清置于-20℃或【huò】-80℃保存，但应【yīng】避免反复冻融。

2. 血浆：用EDTA或肝【gān】素作为抗凝【níng】剂采【cǎi】集标本，并将标本在采集【jí】后的30分钟内于9-21℃ 1000×g离心15分【fèn】钟，取【qǔ】上清即可检测，或将上清置【zhì】于-20℃或-80℃保存，但应避【bì】免反复冻融【róng】。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残【cán】留【liú】血液【yè】（匀浆中裂解【jiě】的红细胞会影响测量【liàng】结果），称重后将组织剪碎。将【jiāng】剪碎的组织与对应【yīng】体积的【de】PBS（一般按1:9的重【chóng】量体积比，比【bǐ】如【rú】1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可【kě】根据实验需【xū】要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入【rù】玻璃匀【yún】浆器中，于冰上充分研磨【mó】。为了【le】进一步【bù】裂【liè】解组【zǔ】织细胞，可以对【duì】匀【yún】浆液进行超声破碎，或【huò】反【fǎn】复冻【dòng】融。将匀浆液【yè】于5000×g离心5~10分钟【zhōng】，取【qǔ】上清检测【cè】。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心【xīn】20分钟，取【qǔ】上清【qīng】即可检测，或将上清置于-20℃或【huò】-80℃保存【cún】，但应避免反复冻融。

5. 其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6. 样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7. 样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可【kě】保【bǎo】存于4℃，若不能及时【shí】检【jiǎn】测，请按【àn】一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反【fǎn】复冻融，标【biāo】本【běn】溶血会影【yǐng】响【xiǎng】检测结果，因【yīn】此【cǐ】溶血【xuè】标本不宜进行此项检测【cè】。

注意事项：

1. 严【yán】格按照规定的【de】时间和温【wēn】度进行【háng】温育以保证【zhèng】准确结果。所有试剂都【dōu】必须在使用前达到【dào】室温9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗【xǐ】板不正确【què】可以导致不准确的结果。在加入底物前确【què】保尽【jìn】量【liàng】吸干【gàn】孔【kǒng】内【nèi】液体。温育过程中不要让微孔干燥【zào】掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应【yīng】试【shì】剂不能接【jiē】触漂白溶【róng】剂或【huò】漂【piāo】白溶剂所散发的强烈气【qì】体。任何漂白成分【fèn】都会破坏试剂盒中反【fǎn】应【yīng】试剂的生物活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果【guǒ】可能传播疾病【bìng】，所有的样品都应管理好，按照规定的程序【xù】处理样品和【hé】检测装【zhuāng】置。

操作步骤：

1．从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需【xū】板条，剩余【yú】板【bǎn】条用自封袋密【mì】封放回【huí】4℃。

2．设置标准【zhǔn】品孔和样本孔，标准品孔各【gè】加【jiā】不【bú】同【tóng】浓【nóng】度的标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除【chú】空白孔外，标【biāo】准品孔和样本孔【kǒng】中【zhōng】每孔加入辣根过氧【yǎng】化物【wù】酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封【fēng】板膜封住反应【yīng】孔，37℃水浴【yù】锅或恒【héng】温箱【xiāng】温育60min。

5．弃【qì】去液体，吸水纸上拍【pāi】干，每孔加满洗涤【dí】液（350μL），静【jìng】置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗【xǐ】板5次（也【yě】可用洗板【bǎn】机洗板）。

6．每孔加入【rù】底物A、B各50μL，37℃避光【guāng】孵育15min。

7．每孔加【jiā】入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定【dìng】各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工【gōng】作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标【biāo】，绘制出标准【zhǔn】品线【xiàn】性回【huí】归曲线，按【àn】曲线方程计算各【gè】样本浓度值【zhí】。

（此图仅供参考）

性能：
1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1. 当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2. 为了【le】避免交叉感染，配【pèi】置不同【tóng】浓度标准品【pǐn】、上样、加不同试【shì】剂【jì】都需要更【gèng】换【huàn】枪头。另外不同试剂请分别使用不同【tóng】的移液【yè】槽。

3. 每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4. 混合后的显【xiǎn】色底物在【zài】上板前应为无色，请避光【guāng】保存【cún】；假如微孔板后，将由物色变成不【bú】同【tóng】深度【dù】的蓝色【sè】。

5. 终止液上板顺序【xù】应同【tóng】显色底物上板顺序一致【zhì】；加入终止液后，孔内【nèi】颜色由蓝变黄；若【ruò】孔【kǒng】内有绿色【sè】，则表明孔内液体【tǐ】未混匀；请【qǐng】充分混合。

说明：

1. 由于现有【yǒu】条件【jiàn】及科学技术水【shuǐ】平尚不能【néng】对所【suǒ】有供货商提供的所有原料进行全面的鉴定与分【fèn】析，本产品【pǐn】可能存在一【yī】定的质量技术【shù】风【fēng】险。

2. 实【shí】验结【jié】果与试剂的有效【xiào】性、实验【yàn】者的相关操作以及当时的实验环境密切相关，请务【wù】必准【zhǔn】备充足【zú】的标本备份。

3. 不同批次的同一【yī】产【chǎn】品【pǐn】可能会有少【shǎo】许差别，如：检测限、灵【líng】敏【mǐn】度以及显色时间等，请【qǐng】依【yī】据试剂盒内【nèi】说明书进行实【shí】验操作，网站电【diàn】子版【bǎn】说明书仅作参考。

4. 只有全部使【shǐ】用本试剂盒配套试剂才能保证检【jiǎn】测效果【guǒ】，不能混用其【qí】他制造商的产品【pǐn】。只【zhī】有严格遵守本试剂【jì】盒的实验说明才会【huì】得到检测结果。