本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒【hé】用于体【tǐ】外【wài】定量检【jiǎn】测【cè】血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中大鼠【shǔ】II型胶原(Col- II)的【de】含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量正【zhèng】常标本检验，标本的正常浓度值均在试【shì】剂【jì】盒【hé】提供的【de】检测范围内，实验过程中直接取50μL样【yàng】本上样【yàng】即【jí】可。当有部分样本值超过最【zuì】大【dà】标准品浓度【dù】时，可【kě】用样本稀【xī】释液将标本【běn】进【jìn】行适当稀释【shì】后再进行实验。

大鼠II型胶原(Col- II)试剂盒检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰箱【xiāng】中取出【chū】的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正【zhèng】常现【xiàn】象；放置室温，轻【qīng】摇均匀，待结晶溶解后再配置洗涤液。可【kě】将20ml浓【nóng】缩洗【xǐ】涤液用蒸【zhēng】馏水【shuǐ】或【huò】去离子【zǐ】水稀【xī】释配置【zhì】成400ml工作浓【nóng】度的洗涤【dí】液，未用完的放回4℃

3.20×洗【xǐ】涤缓冲【chōng】液【yè】的【de】稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲【chōng】液加19份蒸馏【liú】水【shuǐ】。

实验原理：

试【shì】剂盒【hé】采用【yòng】双抗体【tǐ】一步夹心法酶联免疫吸【xī】附试验（ELISA）。往预先包被大鼠【shǔ】II型胶原【yuán】(Col- II)捕获抗体的【de】包被微孔中，依次加入标本、标准品【pǐn】、HRP标记的检测抗体【tǐ】，经过【guò】温【wēn】育并洗涤【dí】。用【yòng】底物【wù】TMB显色，TMB在过氧化物酶【méi】的催化下转化成蓝【lán】色，并在酸的【de】作【zuò】用下转化成最终【zhōng】的黄色。颜色的深浅和样【yàng】品中的大【dà】鼠II型【xíng】胶原(Col- II)呈正相关。用【yòng】酶【méi】标仪在450nm 波【bō】长下测定吸光度【dù】（OD 值），计算样品浓度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪（450nm）

2.高【gāo】精【jīng】度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清：将收集于血清分【fèn】离管的全血标本在室温放置【zhì】2小时【shí】或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟【zhōng】，取【qǔ】上清即【jí】可【kě】，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂【jì】采集标本【běn】，并将标本【běn】在采集后的30分钟内于【yú】9-21℃ 1000×g离心15分【fèn】钟，取上清即可检测，或将【jiāng】上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存【cún】，但应避免【miǎn】反【fǎn】复【fù】冻融。

3.组【zǔ】织匀【yún】浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲【chōng】洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测【cè】量【liàng】结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的【de】组【zǔ】织与【yǔ】对【duì】应【yīng】体积的PBS（一【yī】般按1:9的【de】重量体积比，比如1g的组织【zhī】样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推【tuī】荐在【zài】PBS中【zhōng】加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀【yún】浆器中【zhōng】，于冰上充分【fèn】研磨。为了【le】进一步【bù】裂解组【zǔ】织细【xì】胞【bāo】，可以对匀浆液【yè】进行【háng】超声破【pò】碎，或反复冻融【róng】。最【zuì】后将匀浆液【yè】于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细【xì】胞培养物上清：请1000×g离【lí】心20分钟，取上清即可检【jiǎn】测，或将上清【qīng】置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样【yàng】品【pǐn】保【bǎo】存：样【yàng】品收【shōu】集【jí】后若在【zài】1周内【nèi】进行检测的【de】可保【bǎo】存【cún】于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分【fèn】装，冻存于-20℃（1个月内检【jiǎn】测），或-80℃（6个【gè】月【yuè】内检【jiǎn】测），避免反复冻融，标本溶【róng】血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

注意事项：

1.严格按照【zhào】规定的时间和温度进行温【wēn】育以保证准【zhǔn】确结果【guǒ】。所【suǒ】有试剂都必须【xū】在使用前达到【dào】室【shì】温9-21℃。使用后立即【jí】冷藏保存试剂【jì】。

2.洗板【bǎn】不正确可以【yǐ】导【dǎo】致不准确的结【jié】果。在加入底物前确保尽量吸干孔内【nèi】液【yè】体。温育过【guò】程中不要让微孔干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物显【xiǎn】色液应呈【chéng】无色或很浅的颜【yán】色，已经【jīng】变蓝【lán】的底物液不【bú】能使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反应【yīng】试【shì】剂不能接触【chù】漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白【bái】成【chéng】分都会【huì】破【pò】坏试剂【jì】盒中反【fǎn】应试剂的生物活性【xìng】。

9.不能使用过期产品。

10.如果【guǒ】可能传播疾病，所【suǒ】有的样品都【dōu】应管理好，按照规定的程序处【chù】理样【yàng】品和检测装置【zhì】。

大鼠II型胶原(Col- II)试剂盒操作步骤：

1．从室【shì】温平衡60min后的【de】铝箔袋中取出所需板条【tiáo】，剩余板【bǎn】条【tiáo】用自封【fēng】袋密封放回【huí】4℃。

2．设置标【biāo】准品孔和【hé】样本孔【kǒng】，标准【zhǔn】品孔各加不同【tóng】浓度【dù】的标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空【kōng】白孔外，标【biāo】准品孔和样本【běn】孔【kǒng】中每孔加入【rù】辣根过氧【yǎng】化物酶（HRP）标【biāo】记的检测抗体100μL，用封板膜【mó】封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱【xiāng】温【wēn】育60min。

5．弃去液体，吸【xī】水纸上拍干，每孔加满【mǎn】洗涤液【yè】（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸【zhǐ】上拍干【gàn】，如此重复洗板【bǎn】5次（也可用洗【xǐ】板【bǎn】机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加【jiā】入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定【dìng】各孔【kǒng】的【de】OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以【yǐ】标准品浓度作横坐标【biāo】，对【duì】应OD值作纵坐【zuò】标【biāo】，绘制出标准【zhǔn】品线性【xìng】回归【guī】曲线，按曲【qǔ】线方程计算各【gè】样本浓度值。

（此图仅供参考）

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性：板内变异系数小于10% ，板间【jiān】变异系数小【xiǎo】于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避免交【jiāo】叉【chā】感染，配置不同浓度标准【zhǔn】品、上样【yàng】、加不同试【shì】剂都需要更换【huàn】枪头。另外不同试【shì】剂【jì】请分别使用不同【tóng】的移液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合【hé】后的显【xiǎn】色底物在上板前应为【wéi】无【wú】色，请避光【guāng】保存；假如微孔板后【hòu】，将由【yóu】物色变成不同深度的蓝色。

5.终止液上板顺序【xù】应同【tóng】显色底物【wù】上【shàng】板顺序一致；加入终止液后，孔内【nèi】颜色由蓝【lán】变【biàn】黄；若孔内有绿【lǜ】色，则表【biǎo】明孔内【nèi】液体未混匀；请充分混合。

说明：

1.由于【yú】现有条件及科学技术水平【píng】尚不能对【duì】所有供货商提供【gòng】的所【suǒ】有【yǒu】原料进行全面的【de】鉴定与分析【xī】，本产品可能存在一【yī】定的质【zhì】量技术风险【xiǎn】。

2.最【zuì】终【zhōng】的实验结果【guǒ】与试剂的有效性、实验者的【de】相关操作以及当时的【de】实【shí】验环境密切【qiē】相关，请务必准备【bèi】充足【zú】的标本备份。

3.不同【tóng】批次的同一产【chǎn】品可能会有【yǒu】少许差【chà】别【bié】，如：检测限、灵敏度以【yǐ】及【jí】显色时间等，请依据试剂盒【hé】内【nèi】说明书【shū】进行实验操作【zuò】，网站电【diàn】子版说明书仅作参考。

4.只有全部使用本【běn】试剂盒配套试剂才【cái】能保证【zhèng】检测效果，不能混用【yòng】其【qí】他制造商的【de】产品。只有严【yán】格遵守本试剂盒【hé】的实验说明才【cái】会得到最【zuì】佳的【de】检测结果。