本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒用于体外定量【liàng】检测血清【qīng】、血【xuè】浆、组【zǔ】织匀浆及相关液体样本【běn】中人【rén】CD63分子【zǐ】(CD63)的含量【liàng】。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标【biāo】准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量正【zhèng】常【cháng】标本检验，标【biāo】本的【de】正常浓度值【zhí】均【jun1】在【zài】试【shì】剂盒提供的检测范【fàn】围内，实验过程中直接取50μL样本上样即可【kě】。当有部分样本值超【chāo】过【guò】最【zuì】大【dà】标准品浓度时，可用样本稀释【shì】液将标本进行适当稀释后再进行实验。

人CD63分子(CD63)试剂盒检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰箱中取出【chū】的【de】浓缩洗涤液可能【néng】有结【jié】晶，属于【yú】正【zhèng】常现象；放置室温，轻摇均【jun1】匀，待结晶【jīng】溶解后再配置洗涤液【yè】。可将20ml浓缩洗涤【dí】液用蒸馏水或去离【lí】子水【shuǐ】稀【xī】释配置【zhì】成400ml工作浓度的洗涤液，未用完的放回4℃

3.20×洗涤【dí】缓冲液的稀释：蒸【zhēng】馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤【dí】缓【huǎn】冲液加19份蒸【zhēng】馏水【shuǐ】。

实验原理：

试剂盒采用双【shuāng】抗体【tǐ】一步【bù】夹心法酶【méi】联免疫吸附试验【yàn】（ELISA）。往预先包【bāo】被人CD63分【fèn】子【zǐ】(CD63)捕获抗体的包被【bèi】微孔【kǒng】中，依次加【jiā】入标本、标准品、HRP标记【jì】的检测【cè】抗体，经过温育并洗【xǐ】涤。用【yòng】底【dǐ】物TMB显色，TMB在过氧化物酶【méi】的催化下转化成蓝色【sè】，并在【zài】酸的作用下转化【huà】成最终【zhōng】的黄色。颜色的深浅和样品中的人CD63分子【zǐ】(CD63)呈正相关【guān】。用酶标仪在450nm 波长【zhǎng】下测定吸光【guāng】度（OD 值），计算样【yàng】品【pǐn】浓度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪（450nm）

2.高精度加【jiā】样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血【xuè】清：将收集【jí】于【yú】血【xuè】清分离管的【de】全血标本在室温放【fàng】置2小时或4℃过夜，然【rán】后1000×g离【lí】心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或【huò】-80℃保存，但应避【bì】免反复冻融。

2.血浆：用【yòng】EDTA或肝素作为抗凝剂采集【jí】标本，并【bìng】将标【biāo】本在采集后的【de】30分钟内【nèi】于9-21℃ 1000×g离心15分钟，取上【shàng】清即可检测，或将【jiāng】上【shàng】清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反【fǎn】复【fù】冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲【chōng】洗【xǐ】组织，去除残【cán】留【liú】血【xuè】液（匀【yún】浆【jiāng】中裂解的红细胞会影响测【cè】量结果），称重后将【jiāng】组织剪【jiǎn】碎。将剪碎的组织与【yǔ】对应体积的PBS（一般按1:9的重量体【tǐ】积【jī】比，比如1g的组【zǔ】织样品对应【yīng】9mL的PBS，具体体积可根据实验需要【yào】适当调整，并【bìng】做好【hǎo】记【jì】录。推荐在PBS中加入蛋白酶【méi】抑制【zhì】剂）加【jiā】入玻璃匀浆器中，于【yú】冰上充分研磨【mó】。为了【le】进【jìn】一【yī】步裂解组织细【xì】胞，可以对匀浆液进行超声破【pò】碎，或反复冻【dòng】融。最后【hòu】将匀浆液于5000×g离心5~10分【fèn】钟，取【qǔ】上清检测。

4.细胞【bāo】培养物【wù】上清【qīng】：请1000×g离心20分钟，取上【shàng】清即可检测，或将上【shàng】清置于-20℃或【huò】-80℃保存，但应避免反复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保存【cún】：样品收集【jí】后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按【àn】一次使【shǐ】用量分装【zhuāng】，冻存于-20℃（1个【gè】月内检测），或-80℃（6个【gè】月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响【xiǎng】最【zuì】后检测结果【guǒ】，因此溶血标本【běn】不【bú】宜进行此项检测【cè】。

注意事项：

1.严格按【àn】照规定的时间和温度进行温育以保证准确【què】结【jié】果。所有【yǒu】试剂都必须在使用前达到室温【wēn】9-21℃。使用后立【lì】即冷藏保【bǎo】存【cún】试剂。

2.洗板【bǎn】不正确可以导【dǎo】致不准【zhǔn】确的结果。在加入底物【wù】前确【què】保【bǎo】尽【jìn】量吸干孔内【nèi】液体。温育过程中不要让微孔干燥掉【diào】。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物【wù】显色液应呈无色或很浅的颜色，已经【jīng】变蓝的底物【wù】液【yè】不能使用【yòng】。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反应试【shì】剂不能【néng】接触漂【piāo】白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体【tǐ】。任【rèn】何漂白成分都【dōu】会【huì】破坏试剂盒中反应【yīng】试剂的生【shēng】物活性。

9.不能使用过期产品。

10.如果可能【néng】传播疾病，所有的样品都【dōu】应【yīng】管理好，按【àn】照【zhào】规定的【de】程序处理样品和检测装【zhuāng】置。

人CD63分子(CD63)试剂盒操作步骤：

1．从室【shì】温平衡60min后的铝箔【bó】袋中取出【chū】所需板条，剩余板条用【yòng】自封袋密封放回4℃。

2．设【shè】置标准品孔和样本孔，标准品【pǐn】孔【kǒng】各加不【bú】同浓度的标准【zhǔn】品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔【kǒng】外【wài】，标【biāo】准品【pǐn】孔和样本孔中每孔【kǒng】加【jiā】入辣根过氧化【huà】物酶【méi】（HRP）标记【jì】的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水【shuǐ】浴锅或【huò】恒温箱温育60min。

5．弃去液【yè】体，吸水纸【zhǐ】上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静【jìng】置1min，甩去洗【xǐ】涤液，吸水纸上拍干，如【rú】此重复【fù】洗【xǐ】板【bǎn】5次（也可用洗【xǐ】板机洗板【bǎn】）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加【jiā】入终止液50μL，15min内，在450nm波长【zhǎng】处测定各孔【kǒng】的OD值【zhí】。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工【gōng】作表中，以【yǐ】标【biāo】准品【pǐn】浓度作横坐【zuò】标，对应OD值作纵坐标，绘制【zhì】出标准【zhǔn】品线性回归曲线，按曲线方程计算各样【yàng】本【běn】浓度值。

（此图仅供参考）

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性：板内变异系【xì】数小【xiǎo】于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避免交叉感染，配置不【bú】同【tóng】浓度【dù】标【biāo】准品、上样、加不同试剂【jì】都需要更换枪头【tóu】。另外不同【tóng】试剂请【qǐng】分别使用不同的移液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后【hòu】的【de】显色底物在上板【bǎn】前应为无色，请【qǐng】避光保存【cún】；假如微【wēi】孔板后，将【jiāng】由物色变成不同深度的蓝【lán】色。

5.终止液上板【bǎn】顺序【xù】应同显色底物上板顺【shùn】序一致；加入终【zhōng】止液后【hòu】，孔内颜色由蓝变【biàn】黄；若孔内有绿色【sè】，则表明【míng】孔内液体未混【hún】匀；请充分混合。

说明：

1.由于现【xiàn】有条件及科学技【jì】术水平尚【shàng】不能对所有【yǒu】供货商提【tí】供【gòng】的【de】所有原料进行【háng】全【quán】面的鉴定与分析，本产【chǎn】品可能存【cún】在一定的质量技术风险。

2.最终的实验结果与试剂【jì】的有效【xiào】性、实【shí】验者的【de】相关操作以及【jí】当时的【de】实【shí】验环【huán】境密切相关，请务必准【zhǔn】备充足的标本备份【fèn】。

3.不同【tóng】批次的同一产品可能会【huì】有少【shǎo】许差别，如：检测限、灵敏度以及显【xiǎn】色【sè】时间等，请依据【jù】试剂盒内说明书进行实【shí】验操作，网站电子版【bǎn】说【shuō】明书仅作参考【kǎo】。

4.只有全部使用本试剂【jì】盒配套试剂【jì】才【cái】能【néng】保证【zhèng】检测效果【guǒ】，不能混【hún】用其他制造商的产品。只有严格【gé】遵守本试剂盒的【de】实【shí】验说明才【cái】会得到最佳的检测结【jié】果。