本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒【hé】用于体【tǐ】外定量检测血【xuè】清【qīng】、血浆【jiāng】、组织【zhī】匀浆及相关液【yè】体样本中人CD4分子(CD4)的含量【liàng】。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为【wéi】：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量正【zhèng】常标本检验，标本的正常浓度值均在【zài】试剂盒提供的检测范围内，实【shí】验过程中直接取50μL样本上样即【jí】可。当【dāng】有部【bù】分样【yàng】本值超过最大【dà】标准【zhǔn】品浓【nóng】度时，可用样【yàng】本稀释液【yè】将标本进【jìn】行【háng】适当稀释后再进行【háng】实验。

人CD4分子(CD4)试剂盒检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰【bīng】箱中取【qǔ】出的浓缩洗涤液【yè】可能有【yǒu】结晶，属于正常现象；放【fàng】置室温，轻摇均匀，待结晶溶解后再【zài】配置洗涤液【yè】。可【kě】将【jiāng】20ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离【lí】子水【shuǐ】稀释配置成400ml工【gōng】作浓度的洗涤【dí】液，未用【yòng】完的【de】放回4℃

3.20×洗涤缓冲【chōng】液的稀释：蒸【zhēng】馏水按【àn】1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加【jiā】19份【fèn】蒸馏水。

实验原理：

试剂盒【hé】采用【yòng】双抗体一步夹心法酶【méi】联免疫吸附【fù】试【shì】验（ELISA）。往预先包被人【rén】CD4分子(CD4)捕获抗【kàng】体的包被微【wēi】孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体【tǐ】，经过温育并洗【xǐ】涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶【méi】的【de】催化下转化成蓝【lán】色，并在酸的作用下转化成最终的【de】黄【huáng】色。颜色的深浅和【hé】样品中【zhōng】的人CD4分子【zǐ】(CD4)呈正相关。用酶标【biāo】仪在450nm 波长下测【cè】定【dìng】吸光度【dù】（OD 值），计算样品【pǐn】浓度【dù】。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪（450nm）

2.高精【jīng】度加样【yàng】器【qì】及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清：将收集于【yú】血【xuè】清分离管的全【quán】血标本在室【shì】温【wēn】放【fàng】置2小时【shí】或【huò】4℃过【guò】夜，然后1000×g离心20 分钟【zhōng】，取上清即可，或将上清置于【yú】-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂【jì】采集【jí】标本，并将标【biāo】本【běn】在采集后的30分钟内于9-21℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检【jiǎn】测，或【huò】将【jiāng】上【shàng】清【qīng】置于-20℃或-80℃保存，但应避【bì】免反复冻融。

3.组织匀【yún】浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去【qù】除残【cán】留血液（匀浆中裂解的红细胞会【huì】影【yǐng】响测量结果【guǒ】），称重【chóng】后【hòu】将【jiāng】组织剪【jiǎn】碎【suì】。将剪碎的组织与对【duì】应体积的【de】PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样【yàng】品对应【yīng】9mL的【de】PBS，具体体积可根据实验【yàn】需要适【shì】当调整【zhěng】，并做好记【jì】录【lù】。推荐在PBS中加入蛋白【bái】酶抑【yì】制【zhì】剂）加入玻璃匀浆【jiāng】器中，于【yú】冰上充分研磨【mó】。为了【le】进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声【shēng】破碎，或反复冻【dòng】融。最后【hòu】将匀浆液于5000×g离心【xīn】5~10分钟，取上清检【jiǎn】测。

4.细【xì】胞培养【yǎng】物上清：请【qǐng】1000×g离心20分【fèn】钟，取上清即可【kě】检测，或【huò】将上清置于【yú】-20℃或【huò】-80℃保存，但应避免反复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品【pǐn】保存【cún】：样品收集【jí】后若在【zài】1周内进行检测的可保存于【yú】4℃，若【ruò】不能及时【shí】检【jiǎn】测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月【yuè】内检测），避【bì】免反复【fù】冻融，标本溶血会影响最【zuì】后检测【cè】结果，因此溶【róng】血标本不宜进行此项检测。

注意事项：

1.严格【gé】按照规定的【de】时间和温度【dù】进行温育以保证【zhèng】准确结果。所【suǒ】有试剂都必须在【zài】使用前达到室温9-21℃。使用后立即冷藏【cáng】保存试剂。

2.洗板不正【zhèng】确可以导致不准确的结果。在加入底物前【qián】确【què】保尽【jìn】量吸干【gàn】孔内液体。温育【yù】过程中不要让微孔干燥掉【diào】。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物【wù】显【xiǎn】色液应呈无色或很浅的【de】颜【yán】色，已经【jīng】变蓝的底物液不能使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反应【yīng】试剂不能接触漂白溶【róng】剂或漂白【bái】溶剂所散发的强烈气体。任何漂【piāo】白成【chéng】分都会破坏【huài】试剂【jì】盒中反【fǎn】应试剂的生物活性【xìng】。

9.不能使用过期产品。

10.如果可能【néng】传【chuán】播疾病【bìng】，所有的样品都应管理好，按【àn】照【zhào】规定的程【chéng】序【xù】处理样品和检测装置。

人CD4分子(CD4)试剂盒操作步骤：

1．从室温平衡60min后的铝箔袋中【zhōng】取【qǔ】出所【suǒ】需板条【tiáo】，剩余板条【tiáo】用【yòng】自封袋密封放回4℃。

2．设置标【biāo】准品孔【kǒng】和【hé】样本孔，标准品孔各加【jiā】不同【tóng】浓度的标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，标准品孔和样本孔中每【měi】孔加【jiā】入辣根【gēn】过【guò】氧化物酶（HRP）标记【jì】的【de】检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴【yù】锅或【huò】恒【héng】温【wēn】箱温育60min。

5．弃去液体，吸【xī】水纸上拍【pāi】干，每【měi】孔加【jiā】满洗涤液【yè】（350μL），静【jìng】置【zhì】1min，甩去洗涤液，吸【xī】水纸上拍【pāi】干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每【měi】孔加入终止【zhǐ】液【yè】50μL，15min内，在【zài】450nm波长处测定【dìng】各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表【biǎo】中，以【yǐ】标准品浓度【dù】作【zuò】横【héng】坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品【pǐn】线性回【huí】归曲线，按曲【qǔ】线【xiàn】方程计算【suàn】各样本浓度值。

（此图仅供参考）

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性：板内变异系【xì】数小于10% ，板间变异系【xì】数小于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为【wéi】了避免交叉感染，配置不【bú】同【tóng】浓度标准品【pǐn】、上样、加不同试剂都需要【yào】更换枪头。另【lìng】外【wài】不同试剂请分别使用不同的【de】移液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后的显【xiǎn】色底物在上【shàng】板前应【yīng】为无色【sè】，请避光保存；假如【rú】微【wēi】孔板后，将由物色变成不同深【shēn】度的蓝色【sè】。

5.终止液上板【bǎn】顺【shùn】序应【yīng】同显色底物上【shàng】板顺【shùn】序一致【zhì】；加入终止液后，孔内颜色由蓝变黄；若【ruò】孔内有绿色，则表明孔内【nèi】液体未混匀【yún】；请充分混合【hé】。

说明：

1.由于现有【yǒu】条件及科学技术水平尚【shàng】不能对所有供货商提【tí】供【gòng】的所有【yǒu】原料进行【háng】全【quán】面的【de】鉴定与分析，本产品可能存【cún】在【zài】一定的质量技术风险。

2.最终的实验结果与【yǔ】试剂的有效性、实验者的相关【guān】操【cāo】作【zuò】以及当时【shí】的实【shí】验环境【jìng】密切相关，请务必准备【bèi】充足的【de】标本备份。

3.不【bú】同批次【cì】的同一产品可能会有少【shǎo】许差别【bié】，如：检测【cè】限、灵敏度以及显色时【shí】间等，请依【yī】据试剂【jì】盒内说明书进行【háng】实验操作，网站电子版说明书仅作参考【kǎo】。

4.只有全部使用【yòng】本【běn】试剂【jì】盒【hé】配套试剂才能保证【zhèng】检测效果，不能混【hún】用其他制【zhì】造商的产品【pǐn】。只有严格遵守本试剂【jì】盒的实验说明【míng】才会得到【dào】最佳的【de】检测结果。