本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试【shì】剂【jì】盒【hé】用于体外定量检测血清、血浆【jiāng】、组织匀浆及相关液体【tǐ】样本中牛甲状腺素受体【tǐ】α(THRa)的含【hán】量。

有效期：6个月

保存条件：9-20℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标【biāo】准品浓度依【yī】次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量正常标本检验，标【biāo】本的【de】正【zhèng】常【cháng】浓度值均【jun1】在试【shì】剂盒提供的检测【cè】范围【wéi】内，实验【yàn】过【guò】程中直接取50μL样【yàng】本上样【yàng】即可。当有部分样本值【zhí】超过最大【dà】标准品浓【nóng】度时，可用样本稀【xī】释液将标本进行适当稀释后再进行【háng】实验。

牛甲状腺素受体α(THRa)试剂盒检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从【cóng】冰【bīng】箱中【zhōng】取出的【de】浓缩洗涤液可能有结【jié】晶，属【shǔ】于正常现象；放置【zhì】室温，轻摇均匀，待结晶溶解后再配置洗【xǐ】涤液。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水【shuǐ】或去离子水稀释【shì】配置【zhì】成400ml工作浓度的洗【xǐ】涤液，未【wèi】用【yòng】完【wán】的放回【huí】4℃

3.20×洗涤【dí】缓【huǎn】冲【chōng】液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸【zhēng】馏水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体【tǐ】一【yī】步【bù】夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往【wǎng】预先【xiān】包被牛甲状腺素【sù】受体α(THRa)捕获抗体的包被微【wēi】孔中【zhōng】，依次加入标本、标【biāo】准【zhǔn】品、HRP标记的检测【cè】抗【kàng】体，经过温【wēn】育并【bìng】洗涤【dí】。用底物TMB显色【sè】，TMB在【zài】过氧化物酶的催化【huà】下【xià】转化成蓝色，并在酸的【de】作用下转化成最终【zhōng】的【de】黄色。颜色的深浅和样品中的牛甲状腺素受体α(THRa)呈正相关【guān】。用酶【méi】标仪在450nm 波【bō】长【zhǎng】下测定吸【xī】光度（OD 值），计算样品浓度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪（450nm）

2.高精度加样器及【jí】枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血【xuè】清：将收集于血【xuè】清分【fèn】离管的全【quán】血标本在室温放置2小【xiǎo】时【shí】或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将【jiāng】上清置于-20℃或-80℃保存，但应避【bì】免反复【fù】冻【dòng】融。

2.血【xuè】浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集【jí】标本【běn】，并【bìng】将标本在采集【jí】后的30分钟内于9-20℃ 1000×g离【lí】心【xīn】15分钟，取【qǔ】上清【qīng】即可检测【cè】，或将上【shàng】清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻【dòng】融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织【zhī】，去【qù】除【chú】残【cán】留【liú】血液（匀浆中裂解的红细胞【bāo】会影响【xiǎng】测【cè】量结果），称重后将【jiāng】组织剪【jiǎn】碎。将剪碎【suì】的组织与【yǔ】对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如【rú】1g的组织样品对应9mL的【de】PBS，具体体积可根据实验需【xū】要适当调整，并做【zuò】好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑【yì】制剂）加入玻璃匀浆【jiāng】器【qì】中【zhōng】，于冰上【shàng】充分研磨。为了进一步裂解组织【zhī】细胞【bāo】，可以对匀【yún】浆液进【jìn】行【háng】超声破碎，或反复【fù】冻融。最【zuì】后将匀浆【jiāng】液于5000×g离心5~10分【fèn】钟，取【qǔ】上【shàng】清检【jiǎn】测。

4.细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将【jiāng】上清置于【yú】-20℃或-80℃保【bǎo】存【cún】，但【dàn】应避【bì】免反【fǎn】复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保存：样品收集【jí】后若【ruò】在1周内【nèi】进行检测的可保存【cún】于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装【zhuāng】，冻【dòng】存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测【cè】），避免【miǎn】反复【fù】冻融【róng】，标本溶【róng】血会影响最后检测结果，因此溶血标本不【bú】宜进【jìn】行此项检测。

牛甲状腺素受体α(THRa)试剂盒注意事项：

1.严【yán】格按照规【guī】定的时间和温度进行【háng】温育【yù】以保证准确结【jié】果。所【suǒ】有试剂都必须在使用前达到【dào】室温9-20℃。使用后立即冷藏保【bǎo】存【cún】试剂。

2.洗板不正【zhèng】确可以导致【zhì】不准确【què】的结果。在加入【rù】底【dǐ】物前确保尽量吸【xī】干孔内液【yè】体【tǐ】。温育过程中不【bú】要让微孔干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物【wù】显色液【yè】应【yīng】呈无色或很浅的颜色，已【yǐ】经变蓝【lán】的底物液不能使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反应试剂不【bú】能接触【chù】漂白溶剂或漂白【bái】溶剂所【suǒ】散发的【de】强烈气体。任何漂白成分都【dōu】会破坏【huài】试剂盒中反应试剂的【de】生【shēng】物活性。

9.不能使用过期产品。

10.如果可【kě】能传播【bō】疾病，所有的样【yàng】品【pǐn】都应管理好，按照【zhào】规定的程序【xù】处理样【yàng】品和检测装置。

操作步骤：

1．从室温【wēn】平衡60min后【hòu】的铝【lǚ】箔袋【dài】中【zhōng】取出所需板条，剩余板【bǎn】条用自【zì】封袋密封放回4℃。

2．设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同【tóng】浓【nóng】度的标【biāo】准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，标准【zhǔn】品孔和【hé】样本孔中【zhōng】每【měi】孔加入辣【là】根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体【tǐ】100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴【yù】锅或恒温【wēn】箱【xiāng】温育60min。

5．弃去液体，吸水纸上拍干【gàn】，每孔【kǒng】加满洗【xǐ】涤液（350μL），静【jìng】置1min，甩去洗【xǐ】涤液，吸【xī】水纸上【shàng】拍干，如此重复【fù】洗板【bǎn】5次（也可用【yòng】洗【xǐ】板机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长【zhǎng】处【chù】测【cè】定各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中【zhōng】，以标准【zhǔn】品浓【nóng】度作横【héng】坐标【biāo】，对应OD值作【zuò】纵坐标，绘制出标【biāo】准品线性回归曲线，按曲线方程【chéng】计算各样本浓度【dù】值。

（此图仅供参考）

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重【chóng】复性：板内变异系数小【xiǎo】于【yú】10% ，板【bǎn】间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避【bì】免交叉感染【rǎn】，配【pèi】置不同浓度标准品、上样【yàng】、加【jiā】不同试【shì】剂都需要【yào】更换枪头。另外不同试剂请分别使用不同的移液槽【cáo】。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后的【de】显色底物在上板前应为【wéi】无【wú】色，请【qǐng】避光保存；假如【rú】微孔【kǒng】板后，将由【yóu】物色变成不同深【shēn】度的蓝【lán】色。

5.终止液上板顺序应【yīng】同【tóng】显色底物上板顺序一致【zhì】；加【jiā】入终止液【yè】后，孔内颜色由蓝变黄；若孔内有绿色【sè】，则表明孔内【nèi】液【yè】体未混【hún】匀；请充分混【hún】合【hé】。

说明：

1.由于现有【yǒu】条件及科学技术水平【píng】尚不【bú】能对所有供货商提【tí】供的所有原料进【jìn】行全面【miàn】的鉴定与分析，本产品可能存在一定【dìng】的质量技术风险【xiǎn】。

2.最终的【de】实【shí】验【yàn】结果与试剂的有效性【xìng】、实验者的相关操【cāo】作以及当【dāng】时【shí】的实【shí】验环境密切相关【guān】，请务必准备充足的标本备份【fèn】。

3.不同批次的同一【yī】产品可能会有少【shǎo】许差别，如：检测【cè】限【xiàn】、灵敏度以【yǐ】及显色时间等，请依据试剂盒【hé】内说明书进行实验操【cāo】作，网站电【diàn】子版说【shuō】明书仅【jǐn】作【zuò】参考。

4.只【zhī】有全【quán】部使用本试剂盒配【pèi】套试剂才能保证检测【cè】效果，不能混用其他【tā】制造商的【de】产品。只有严格遵守本试【shì】剂【jì】盒【hé】的实验说明才会得【dé】到最佳【jiā】的检测结果【guǒ】。