本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂【jì】盒用于体外定量检测血清、血浆、组织【zhī】匀【yún】浆及相关【guān】液【yè】体样本【běn】中猪左右决定因【yīn】子1(LEFTY1)的含量【liàng】。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过【guò】大量正常标【biāo】本检验，标本的正【zhèng】常【cháng】浓度值【zhí】均在试剂盒【hé】提供【gòng】的检测范围【wéi】内，实验过程中直接取50μL样【yàng】本上样即可。当有部分样本值超【chāo】过最【zuì】大标准品浓【nóng】度时，可用样本稀释液将标【biāo】本【běn】进行【háng】适当稀释后【hòu】再进行实验。

猪左右决定因子1(LEFTY1)试剂盒检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰箱中【zhōng】取出【chū】的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象；放置室温【wēn】，轻摇均【jun1】匀，待结晶溶解后再配置洗涤液【yè】。可【kě】将【jiāng】20ml浓缩洗涤【dí】液用【yòng】蒸馏水或【huò】去离子水稀释配【pèi】置成【chéng】400ml工【gōng】作浓度【dù】的【de】洗涤液，未用完的【de】放回4℃

3.20×洗涤【dí】缓冲液【yè】的稀释：蒸【zhēng】馏水按【àn】1：20稀释，即【jí】1份20×洗涤缓冲液【yè】加19份蒸馏水。

实验原理：

试剂盒采【cǎi】用双抗体一步夹心法酶联【lián】免疫【yì】吸附【fù】试验（ELISA）。往预先包被猪左右决【jué】定因子1(LEFTY1)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体【tǐ】，经过【guò】温育并洗【xǐ】涤。用底物TMB显【xiǎn】色，TMB在过氧化物酶【méi】的催化下转化成蓝色，并在酸的【de】作用下转【zhuǎn】化成最【zuì】终【zhōng】的黄色。颜【yán】色【sè】的【de】深浅和样品中【zhōng】的猪左右【yòu】决定因【yīn】子1(LEFTY1)呈正相关。用【yòng】酶标仪在450nm 波长【zhǎng】下测定吸光度（OD 值【zhí】），计【jì】算样品浓【nóng】度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪（450nm）

2.高精度加样器【qì】及枪【qiāng】头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清【qīng】：将收【shōu】集于血清分【fèn】离管【guǎn】的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟【zhōng】，取上清即【jí】可，或将上清置于-20℃或【huò】-80℃保存，但应避免【miǎn】反复冻融。

2.血浆【jiāng】：用【yòng】EDTA或肝素【sù】作为抗凝剂采集标本，并将【jiāng】标本在采集后【hòu】的30分钟内于9-21℃ 1000×g离【lí】心【xīn】15分钟，取【qǔ】上清即可检测【cè】，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但【dàn】应避免反复冻融。

3.组【zǔ】织匀浆：用预冷的【de】PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织【zhī】，去除残【cán】留血液（匀浆中裂解【jiě】的红【hóng】细胞会影响测量结果），称【chēng】重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体【tǐ】积的【de】PBS（一【yī】般按1:9的重量体【tǐ】积比【bǐ】，比如1g的【de】组织样【yàng】品对应【yīng】9mL的【de】PBS，具体体积可根据【jù】实验【yàn】需要适当调整【zhěng】，并做【zuò】好记录【lù】。推荐在【zài】PBS中【zhōng】加入蛋【dàn】白酶【méi】抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于【yú】冰上充分研【yán】磨。为了进一步裂解组织细胞【bāo】，可【kě】以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最【zuì】后将匀【yún】浆液于5000×g离心5~10分钟【zhōng】，取上清检测。

4.细胞培养物上【shàng】清：请1000×g离【lí】心20分钟，取上清即可检测，或将【jiāng】上清【qīng】置于-20℃或【huò】-80℃保存【cún】，但应避免反复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样【yàng】品保【bǎo】存：样品【pǐn】收集后【hòu】若在1周内进行检测的可【kě】保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使【shǐ】用【yòng】量【liàng】分装，冻存【cún】于-20℃（1个【gè】月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶【róng】血会影响最【zuì】后检测结果，因此溶血标本不宜进行【háng】此项检测。

注意事项：

1.严【yán】格【gé】按照规【guī】定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达【dá】到【dào】室温9-21℃。使用【yòng】后立即冷藏保存试【shì】剂。

2.洗板不正确可以导致不准【zhǔn】确【què】的结果。在加入底物【wù】前确【què】保尽量吸【xī】干孔【kǒng】内【nèi】液【yè】体。温育【yù】过程中不要让微孔干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底【dǐ】物显色液应呈无【wú】色或很浅的颜【yán】色，已【yǐ】经变蓝的【de】底物液不能【néng】使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反应试剂不能接触漂【piāo】白【bái】溶剂或【huò】漂白溶剂所【suǒ】散【sàn】发的强【qiáng】烈气【qì】体。任何漂【piāo】白成分都会【huì】破坏试剂盒中反应【yīng】试剂的生物活性。

9.不能使用过期产品。

10.如果可能传播【bō】疾病，所有的样品都应【yīng】管理【lǐ】好，按照规【guī】定的程序处【chù】理样品和检【jiǎn】测装置。

操作步骤：

1．从室【shì】温平衡60min后的【de】铝箔袋中取出所需板条，剩【shèng】余板条用自封袋密封【fēng】放回【huí】4℃。

2．设置标准品孔【kǒng】和样本【běn】孔【kǒng】，标【biāo】准品孔各【gè】加不同浓度的标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空【kōng】白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧【yǎng】化物酶（HRP）标记【jì】的检测抗体100μL，用封板【bǎn】膜【mó】封住反应孔，37℃水浴【yù】锅或恒温【wēn】箱温【wēn】育60min。

5．弃去液【yè】体，吸水纸上拍【pāi】干，每【měi】孔【kǒng】加【jiā】满【mǎn】洗涤液（350μL），静【jìng】置1min，甩去洗【xǐ】涤液，吸水纸上拍干【gàn】，如此【cǐ】重复洗板【bǎn】5次（也可用洗板机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加【jiā】入终止液【yè】50μL，15min内，在450nm波【bō】长处测定【dìng】各孔的【de】OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工【gōng】作表【biǎo】中，以标准品浓度【dù】作横坐标，对【duì】应【yīng】OD值【zhí】作纵【zòng】坐标【biāo】，绘制【zhì】出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

（此图仅供参考）

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重【chóng】复性：板内变异系数【shù】小【xiǎo】于10% ，板间变异系【xì】数小【xiǎo】于15% 。

猪左右决定因子1(LEFTY1)试剂盒技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避免【miǎn】交叉感染，配置【zhì】不同浓度【dù】标准品、上样、加【jiā】不【bú】同试剂都需要更换枪头【tóu】。另外不同试剂请分别使用【yòng】不同的移液槽【cáo】。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后的显色底物【wù】在上【shàng】板前应【yīng】为【wéi】无色【sè】，请避光保存；假如【rú】微孔板后，将由物【wù】色变【biàn】成不同深度的蓝色。

5.终止液上【shàng】板顺序应同显【xiǎn】色底物上【shàng】板顺【shùn】序一致；加【jiā】入【rù】终止【zhǐ】液后，孔内颜色由蓝变黄【huáng】；若孔内有绿色，则表明孔【kǒng】内液体未【wèi】混匀；请充分混合。

说明：

1.由于现有条件及科学【xué】技术水平【píng】尚不能对所有供货商提供的【de】所有原【yuán】料进行【háng】全面【miàn】的鉴【jiàn】定与分【fèn】析【xī】，本产品可能存【cún】在一定的质量技术风险【xiǎn】。

2.最终的实验结果【guǒ】与试【shì】剂的有效性、实验者的相关【guān】操作以【yǐ】及当时的【de】实验环【huán】境密【mì】切相关【guān】，请【qǐng】务必准【zhǔn】备充足的标本备份。

3.不【bú】同批次的同【tóng】一产品可能会有少许【xǔ】差别，如：检测限、灵敏度以及显色时间【jiān】等，请依据【jù】试剂盒内说明书进行实【shí】验操作，网【wǎng】站【zhàn】电子版说【shuō】明书仅作参考【kǎo】。

4.只有【yǒu】全部使【shǐ】用【yòng】本试剂盒配套试剂才能保【bǎo】证检测【cè】效果，不能混用其他制造商的产品。只有严格遵【zūn】守本【běn】试剂盒的实验【yàn】说明才会得到最【zuì】佳【jiā】的检测结【jié】果。