本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒用于体外定量【liàng】检【jiǎn】测血清、血浆、组织【zhī】匀【yún】浆及相关液体【tǐ】样【yàng】本中小鼠5-羟【qiǎng】色胺受体4(HTR4)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准【zhǔn】品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量正常标本检验，标【biāo】本的【de】正常浓度值均在【zài】试剂盒提供的检测【cè】范【fàn】围【wéi】内，实验【yàn】过程中直接取50μL样本上【shàng】样即可。当有部分样【yàng】本值超过最大标准【zhǔn】品【pǐn】浓度时，可用样本【běn】稀释【shì】液将标本进【jìn】行适当稀释【shì】后再进行【háng】实验。

小鼠5-羟色胺受体4(HTR4)试剂盒检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从【cóng】冰【bīng】箱中取出【chū】的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象【xiàng】；放【fàng】置室温，轻摇均匀，待结晶【jīng】溶解【jiě】后再配置洗涤液。可将【jiāng】20ml浓【nóng】缩洗【xǐ】涤液用蒸馏水或去离【lí】子水【shuǐ】稀释配置成400ml工作浓度的洗【xǐ】涤液【yè】，未用完【wán】的放回【huí】4℃

3.20×洗涤缓冲液【yè】的【de】稀释：蒸【zhēng】馏水【shuǐ】按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

实验原理：

试【shì】剂盒采用双抗体一步夹心【xīn】法酶联【lián】免【miǎn】疫吸附试验（ELISA）。往预先包被小鼠5-羟色胺【àn】受体4(HTR4)捕获抗体的【de】包被【bèi】微孔【kǒng】中，依次加入【rù】标本、标准品、HRP标记的检测【cè】抗【kàng】体，经【jīng】过【guò】温育并洗涤。用底物TMB显色，TMB在【zài】过氧化物酶【méi】的催化下【xià】转化成蓝色，并在酸的作【zuò】用下转化成最终的黄【huáng】色【sè】。颜色【sè】的深浅和样品【pǐn】中的小鼠5-羟色胺受【shòu】体4(HTR4)呈正相【xiàng】关。用【yòng】酶【méi】标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样【yàng】品【pǐn】浓度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪（450nm）

2.高【gāo】精度加样【yàng】器【qì】及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清：将收集于血清分离管的全血标【biāo】本在【zài】室温【wēn】放置【zhì】2小时【shí】或4℃过夜，然后1000×g离心【xīn】20 分钟，取上【shàng】清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但【dàn】应避免反【fǎn】复冻融【róng】。

2.血浆：用EDTA或【huò】肝素作为抗凝【níng】剂采集标本，并将标【biāo】本在采集后的30分【fèn】钟内【nèi】于9-21℃ 1000×g离心15分钟，取【qǔ】上清【qīng】即可检测【cè】，或将上清【qīng】置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用【yòng】预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后【hòu】将组织剪【jiǎn】碎【suì】。将剪碎的组【zǔ】织【zhī】与【yǔ】对应体【tǐ】积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的【de】组织样【yàng】品【pǐn】对【duì】应9mL的PBS，具【jù】体体积可【kě】根据【jù】实【shí】验需要适当调整，并做好记【jì】录【lù】。推荐【jiàn】在PBS中加入蛋白酶抑制【zhì】剂）加入玻璃匀浆【jiāng】器中，于冰【bīng】上充分研磨。为【wéi】了进一步裂解【jiě】组【zǔ】织细【xì】胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复【fù】冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟【zhōng】，取上清检测。

4.细胞培【péi】养物上清：请1000×g离心【xīn】20分钟，取上清即可【kě】检【jiǎn】测，或【huò】将上清置于【yú】-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样【yàng】品【pǐn】保存：样品收集后若【ruò】在1周内进行检测的【de】可保存【cún】于4℃，若不能及时检测，请按【àn】一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测【cè】），避免反复冻融，标本【běn】溶血会影响【xiǎng】最【zuì】后检测结果，因此溶【róng】血标本不【bú】宜进行此项【xiàng】检测。

注意事项：

1.严格按【àn】照【zhào】规定的【de】时间和【hé】温度进行温育以保证准确结果。所有试剂【jì】都必须在使用【yòng】前达到室温9-21℃。使用后立【lì】即【jí】冷【lěng】藏保存试剂。

2.洗板不【bú】正确【què】可以导致【zhì】不准确的【de】结果。在加【jiā】入底物前确保尽量吸干【gàn】孔内液体。温育过程中【zhōng】不【bú】要让微孔【kǒng】干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物显色液应呈无色或很浅【qiǎn】的【de】颜【yán】色【sè】，已经变【biàn】蓝的底物液不能使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何【hé】反应试剂不能接触【chù】漂白溶剂【jì】或【huò】漂白【bái】溶剂所散【sàn】发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒【hé】中反【fǎn】应试剂【jì】的生【shēng】物活性。

9.不能使用过期产品。

10.如果可能传【chuán】播疾病，所有【yǒu】的【de】样品都应管理好，按照规定【dìng】的程序处理【lǐ】样品【pǐn】和检【jiǎn】测装置。

小鼠5-羟色胺受体4(HTR4)试剂盒操作步骤：

1．从室【shì】温【wēn】平衡60min后的【de】铝箔【bó】袋中取出所需板条【tiáo】，剩【shèng】余板条用自封袋密封放回4℃。

2．设置标准【zhǔn】品孔和样本孔，标准品【pǐn】孔各加【jiā】不【bú】同浓度的标准品【pǐn】50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除【chú】空白孔外，标【biāo】准品孔和样本孔中【zhōng】每孔加入辣根过氧化【huà】物酶（HRP）标记的检测抗【kàng】体【tǐ】100μL，用封【fēng】板膜封住反应【yīng】孔，37℃水浴锅或恒【héng】温箱温育60min。

5．弃去液【yè】体，吸水纸上拍干，每孔加满洗【xǐ】涤液【yè】（350μL），静置1min，甩【shuǎi】去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可【kě】用洗板【bǎn】机洗板【bǎn】）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波【bō】长【zhǎng】处【chù】测定各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工【gōng】作表中，以标准品浓【nóng】度【dù】作横坐【zuò】标，对应OD值作纵坐标，绘【huì】制出标【biāo】准品线性回归曲线，按【àn】曲线方程计算【suàn】各样【yàng】本浓度值。

（此图仅供参考）

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性：板内变【biàn】异【yì】系数【shù】小于10% ，板间变异系数小于【yú】15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了【le】避免交叉感染，配置【zhì】不同浓度标准品、上样、加不同试剂都【dōu】需要更换枪头。另【lìng】外不同试【shì】剂【jì】请分别使【shǐ】用不【bú】同的移液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后的显色底【dǐ】物在上板前应为【wéi】无色【sè】，请避光保存；假【jiǎ】如微孔板后，将【jiāng】由物色变【biàn】成不【bú】同深度的蓝色【sè】。

5.终止液上板顺序应同显色底物上【shàng】板顺序一致【zhì】；加【jiā】入【rù】终【zhōng】止液后【hòu】，孔内颜色由【yóu】蓝变黄；若孔内有【yǒu】绿色，则表明孔内液体未混【hún】匀；请充【chōng】分混合。

说明：

1.由于现有【yǒu】条件及【jí】科【kē】学技术水平尚不能对所有供货商提供的【de】所有原料进【jìn】行全【quán】面的【de】鉴定【dìng】与分析，本产品可能【néng】存在一定的质量技术风险。

2.最【zuì】终的实验结果【guǒ】与试剂【jì】的有效性、实验者的【de】相关操作以【yǐ】及当时的实验环【huán】境密切【qiē】相关，请【qǐng】务必准【zhǔn】备充足的标本备份。

3.不同批次的同一【yī】产【chǎn】品可能会有少【shǎo】许差【chà】别，如【rú】：检测限、灵敏度以及显色时【shí】间等，请依据试【shì】剂【jì】盒内说明【míng】书进行实验操作，网站【zhàn】电子版说明书【shū】仅作【zuò】参考。

4.只有【yǒu】全部使用本试剂盒配【pèi】套试剂【jì】才能保证检测效果，不【bú】能混【hún】用【yòng】其他制【zhì】造商【shāng】的产品。只有严格遵守本试剂盒【hé】的实验说明才会得到最【zuì】佳的检【jiǎn】测【cè】结果。