本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本【běn】试【shì】剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组【zǔ】织匀浆及相【xiàng】关液体样【yàng】本中大【dà】鼠5-羟【qiǎng】色胺【àn】受体4(HTR4)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次【cì】为【wéi】：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经【jīng】过【guò】大量正【zhèng】常标本检验，标【biāo】本的正【zhèng】常浓度【dù】值均在【zài】试剂盒提供的检【jiǎn】测范围内，实验过【guò】程中直接取50μL样本上样即可。当有【yǒu】部分样本值【zhí】超过【guò】最大标准品浓【nóng】度时，可用样【yàng】本稀释液将【jiāng】标本进行适当稀释后再进行【háng】实验。

大鼠5-羟色胺受体4(HTR4)试剂盒检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰【bīng】箱中取出【chū】的浓缩【suō】洗涤液可能有【yǒu】结晶【jīng】，属【shǔ】于正常【cháng】现象；放置室【shì】温，轻摇均匀，待结晶溶解后再配置洗涤液【yè】。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏【liú】水或去离子水稀【xī】释【shì】配置成400ml工作浓度的洗涤液【yè】，未用完的【de】放【fàng】回4℃

3.20×洗涤缓【huǎn】冲液的【de】稀释：蒸馏水按【àn】1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲【chōng】液加【jiā】19份蒸馏水【shuǐ】。

实验原理：

试剂盒采用【yòng】双【shuāng】抗【kàng】体一【yī】步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先【xiān】包被【bèi】大鼠5-羟色【sè】胺受体4(HTR4)捕获抗【kàng】体的【de】包被微孔中，依次加【jiā】入标本【běn】、标准品、HRP标记的检测抗【kàng】体，经过【guò】温【wēn】育【yù】并洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成【chéng】蓝色【sè】，并在酸的【de】作【zuò】用下转化成最终的黄色。颜色的深【shēn】浅和样品中【zhōng】的大鼠5-羟色胺受体4(HTR4)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计【jì】算样品浓【nóng】度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪（450nm）

2.高【gāo】精度加样器及【jí】枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清：将收集于【yú】血清分离管的全【quán】血标本在室【shì】温【wēn】放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置【zhì】于-20℃或-80℃保存，但应【yīng】避【bì】免反复冻融【róng】。

2.血浆【jiāng】：用EDTA或肝素作为抗【kàng】凝剂采【cǎi】集标本，并将标本在【zài】采【cǎi】集后的30分钟内于9-21℃ 1000×g离心15分钟，取上【shàng】清【qīng】即【jí】可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应【yīng】避免反复冻融【róng】。

3.组织匀浆【jiāng】：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织【zhī】，去【qù】除残【cán】留血液（匀浆中裂解【jiě】的红细胞会影响【xiǎng】测量结【jié】果【guǒ】），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体【tǐ】积的【de】PBS（一般按【àn】1:9的重量体积比【bǐ】，比【bǐ】如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据【jù】实验需要适当调整，并做【zuò】好记录。推【tuī】荐在【zài】PBS中加入蛋白酶抑制剂【jì】）加【jiā】入【rù】玻【bō】璃【lí】匀浆器中，于冰【bīng】上充分【fèn】研【yán】磨。为了进【jìn】一步【bù】裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融【róng】。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分【fèn】钟，取【qǔ】上清检【jiǎn】测。

4.细胞培养物【wù】上清：请1000×g离心20分钟，取上清【qīng】即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应避【bì】免反复冻融【róng】。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品【pǐn】保存：样品收集后若在【zài】1周内【nèi】进行检测的【de】可保存于【yú】4℃，若不能及时检测【cè】，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个【gè】月内检测），或-80℃（6个月【yuè】内检测），避免反复冻融，标【biāo】本【běn】溶【róng】血【xuè】会【huì】影响最后检测【cè】结果，因此溶血标本不宜进行此【cǐ】项【xiàng】检测。

注意事项：

1.严格按照【zhào】规【guī】定【dìng】的时间和温度进行温育以保证【zhèng】准确结果。所有试【shì】剂都【dōu】必须在使用前【qián】达到室温9-21℃。使用后立即【jí】冷藏保【bǎo】存试剂。

2.洗板【bǎn】不正【zhèng】确可以导致不准【zhǔn】确的结果。在【zài】加入【rù】底物前确保尽量吸干孔内液体【tǐ】。温【wēn】育过程中不要让微【wēi】孔干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物显【xiǎn】色【sè】液应呈无【wú】色或【huò】很浅的颜【yán】色，已经变蓝的底物【wù】液不能使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反应试剂不能接触漂白【bái】溶剂或【huò】漂白溶剂所散发的强【qiáng】烈【liè】气体【tǐ】。任何【hé】漂白【bái】成【chéng】分都会破坏试剂【jì】盒中反应试剂的生物活【huó】性。

9.不能使用过期产品。

10.如果可能传播疾【jí】病，所有的样品都应管理好，按照规【guī】定【dìng】的程序处【chù】理样【yàng】品和检测装置【zhì】。

大鼠5-羟色胺受体4(HTR4)试剂盒操作步骤：

1．从【cóng】室温平衡60min后【hòu】的铝箔袋中取出所需板条，剩余板【bǎn】条用【yòng】自【zì】封袋密封放【fàng】回4℃。

2．设置标准品孔【kǒng】和样本孔，标准品【pǐn】孔各加不同浓度的标准【zhǔn】品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，标【biāo】准【zhǔn】品孔和样本孔中每【měi】孔加入辣【là】根过氧化【huà】物酶（HRP）标记【jì】的检测抗体【tǐ】100μL，用封板【bǎn】膜封住反应孔，37℃水【shuǐ】浴锅或【huò】恒温箱温【wēn】育60min。

5．弃去液体，吸【xī】水纸上拍干【gàn】，每孔【kǒng】加满洗涤液【yè】（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如【rú】此【cǐ】重复【fù】洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔【kǒng】加【jiā】入终止液50μL，15min内，在【zài】450nm波长处测【cè】定各【gè】孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对【duì】应OD值【zhí】作纵坐标，绘【huì】制出【chū】标【biāo】准品【pǐn】线性回【huí】归【guī】曲线，按曲线方程计算各样本浓度【dù】值。

（此图仅供参考）

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重【chóng】复【fù】性：板内变异【yì】系数小于【yú】10% ，板间变异【yì】系数小于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了【le】避免交叉【chā】感【gǎn】染，配置不同浓度【dù】标准【zhǔn】品、上样、加不同试剂都需要更换枪头。另外【wài】不同【tóng】试【shì】剂请分别使用【yòng】不同的移液槽【cáo】。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后的显【xiǎn】色底物【wù】在上板前应【yīng】为无色【sè】，请避光保存；假【jiǎ】如微孔【kǒng】板后【hòu】，将由物色变成不【bú】同深度的蓝色。

5.终止液【yè】上【shàng】板顺【shùn】序应同显色底物上板顺序【xù】一【yī】致；加【jiā】入终止液后，孔内颜色由蓝变黄；若孔内【nèi】有绿色，则表明【míng】孔内【nèi】液体未混匀；请充【chōng】分混合。

说明：

1.由于现有条【tiáo】件及【jí】科学技术水平【píng】尚不【bú】能对所【suǒ】有【yǒu】供货【huò】商提供的所【suǒ】有原料进行全面的鉴定与分析，本产品可能【néng】存在【zài】一定的质量技术风【fēng】险。

2.最【zuì】终的实验结果与试剂的有【yǒu】效【xiào】性、实验者【zhě】的相关操作【zuò】以及当时的实验【yàn】环境密切相【xiàng】关【guān】，请务必准备充足的【de】标【biāo】本备份。

3.不同批次【cì】的同一产品【pǐn】可能会有少许差别，如：检测限、灵敏【mǐn】度【dù】以及【jí】显色【sè】时【shí】间等，请依据试剂【jì】盒内说明书进【jìn】行【háng】实验操作【zuò】，网站电子版说明书仅【jǐn】作参考。

4.只有全部使用本【běn】试剂盒配套试剂才能保证检测【cè】效果，不能混用其【qí】他制【zhì】造商的产品。只【zhī】有严格遵守本试剂【jì】盒的【de】实【shí】验说明才【cái】会【huì】得到最佳的检测【cè】结果。