本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂【jì】盒【hé】用【yòng】于体外定量检测【cè】血【xuè】清【qīng】、血浆【jiāng】、组织匀浆及相关液体样本中人Ⅱ型胶原(Col-Ⅱ)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-20℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依【yī】次【cì】为【wéi】：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量正【zhèng】常标本检验，标本【běn】的正【zhèng】常【cháng】浓【nóng】度值均在试剂盒【hé】提供的检测范围内，实验过程中直接取50μL样【yàng】本【běn】上【shàng】样即可【kě】。当有部分样本【běn】值超过【guò】最大标准品浓【nóng】度时【shí】，可用【yòng】样本稀【xī】释液将标本进行适当稀释后【hòu】再进行实验。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰箱中【zhōng】取出的浓缩【suō】洗涤液可【kě】能有结晶【jīng】，属【shǔ】于正常现【xiàn】象；放置室温，轻摇均【jun1】匀，待结晶溶【róng】解后【hòu】再配置洗涤液。可将20ml浓【nóng】缩洗涤【dí】液用【yòng】蒸馏水或去离子水稀【xī】释配置成400ml工作【zuò】浓度的洗涤液【yè】，未用完的放回4℃

3.20×洗涤缓冲【chōng】液的稀释：蒸馏【liú】水按1：20稀释，即【jí】1份【fèn】20×洗涤缓冲液加19份蒸馏【liú】水。

实验原理：

试剂盒【hé】采用【yòng】双抗体一步夹【jiá】心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往【wǎng】预先【xiān】包被人Ⅱ型胶【jiāo】原(Col-Ⅱ)捕获抗体的包被微【wēi】孔中，依次加入标本【běn】、标准品、HRP标记的【de】检【jiǎn】测抗体，经【jīng】过温育【yù】并洗【xǐ】涤。用底物TMB显色，TMB在过【guò】氧化物酶的催化下【xià】转化成蓝【lán】色，并在酸的作用下转化成最终的【de】黄色。颜色的【de】深浅和样品中的人【rén】Ⅱ型胶原(Col-Ⅱ)呈正相关。用酶标仪【yí】在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓【nóng】度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪（450nm）

2.高精【jīng】度加样器及【jí】枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血【xuè】清：将收集于血清分离管的全血标本【běn】在室温【wēn】放【fàng】置2小【xiǎo】时或4℃过夜，然后【hòu】1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将【jiāng】上清置于-20℃或-80℃保存，但【dàn】应避免反复【fù】冻融。

2.血浆：用EDTA或肝【gān】素作【zuò】为抗凝剂采集标【biāo】本，并【bìng】将标本在采【cǎi】集后的30分钟内于9-20℃ 1000×g离心15分钟，取【qǔ】上清即可检测，或将上【shàng】清【qīng】置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应避【bì】免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的【de】PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗【xǐ】组织，去除【chú】残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与【yǔ】对应体积【jī】的PBS（一般按1:9的重量体【tǐ】积比，比如【rú】1g的组织【zhī】样品对应9mL的PBS，具体体积【jī】可根【gēn】据实验需要适当调整【zhěng】，并做【zuò】好记录【lù】。推荐在PBS中加【jiā】入蛋白酶抑制剂）加【jiā】入玻【bō】璃【lí】匀浆器中，于【yú】冰上充【chōng】分研【yán】磨。为了进【jìn】一步裂【liè】解组织细胞，可以对匀浆液进行超【chāo】声破碎，或反【fǎn】复冻融【róng】。最【zuì】后将【jiāng】匀浆液于5000×g离心5~10分钟【zhōng】，取上清检测。

4.细胞培养【yǎng】物上【shàng】清：请1000×g离心20分钟，取【qǔ】上清即可检【jiǎn】测，或将上清置【zhì】于-20℃或-80℃保存，但【dàn】应避免反【fǎn】复冻【dòng】融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可保存【cún】于4℃，若不能及时【shí】检测，请按一次使用【yòng】量分装，冻存于-20℃（1个月【yuè】内【nèi】检测【cè】），或-80℃（6个月内检【jiǎn】测【cè】），避免【miǎn】反【fǎn】复【fù】冻融，标本溶【róng】血会【huì】影响最后检测结果【guǒ】，因此溶血标【biāo】本不宜进行此【cǐ】项检测。

注意事项：

1.严格按照规定的时间和温【wēn】度进行温【wēn】育以保证准确结果。所【suǒ】有试剂都必须【xū】在使用前达【dá】到室温【wēn】9-20℃。使用【yòng】后立即冷【lěng】藏保存试剂【jì】。

2.洗板不正确【què】可以导致【zhì】不准确【què】的结果。在加【jiā】入底物【wù】前确【què】保尽量吸干孔内【nèi】液体【tǐ】。温【wēn】育过程中不要让微孔干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物【wù】显色液应呈无色或【huò】很浅【qiǎn】的颜色，已经变蓝【lán】的底物【wù】液不能【néng】使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何【hé】反【fǎn】应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的【de】强烈气体。任【rèn】何漂【piāo】白成【chéng】分都会破坏【huài】试剂【jì】盒中反应试剂的【de】生物【wù】活性。

9.不能使用过期产品。

10.如果可能传播【bō】疾【jí】病，所有【yǒu】的样品都【dōu】应管理【lǐ】好，按照规定的程【chéng】序处理样品和【hé】检测装置。

操作步骤：

1．从室【shì】温平衡60min后【hòu】的【de】铝箔袋中取【qǔ】出所需板条，剩余板条用自封【fēng】袋【dài】密封放回4℃。

2．设置标准品孔和样本孔【kǒng】，标【biāo】准品孔【kǒng】各加不同浓【nóng】度【dù】的标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除【chú】空白【bái】孔外，标准【zhǔn】品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶【méi】（HRP）标记的【de】检测抗体100μL，用封板膜封住反应【yīng】孔【kǒng】，37℃水浴锅或恒【héng】温箱温育60min。

5．弃去液【yè】体，吸水纸【zhǐ】上拍干【gàn】，每孔加满洗涤液【yè】（350μL），静置1min，甩去洗涤液【yè】，吸水纸上拍【pāi】干，如此重复洗板5次（也可用洗【xǐ】板机洗板【bǎn】）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每【měi】孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长【zhǎng】处测定各孔的【de】OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表【biǎo】中，以标准品浓度作横坐【zuò】标，对应OD值作纵坐标，绘制出【chū】标【biāo】准【zhǔn】品线性回归曲线，按曲线【xiàn】方程计算【suàn】各样【yàng】本【běn】浓度【dù】值。

（此图仅供参考）

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性：板【bǎn】内变异【yì】系数小【xiǎo】于10% ，板间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避【bì】免交叉感染【rǎn】，配置不同【tóng】浓度标【biāo】准品、上样、加不同试剂都需【xū】要更换枪头。另【lìng】外【wài】不同试剂【jì】请分【fèn】别使用不同的移【yí】液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后【hòu】的【de】显色底物在上板前应为无色，请避光保存；假【jiǎ】如微【wēi】孔【kǒng】板后，将由物色【sè】变成【chéng】不同深【shēn】度的蓝色。

5.终【zhōng】止【zhǐ】液上板【bǎn】顺【shùn】序应同显色底物上板顺序一致；加入终【zhōng】止液后，孔【kǒng】内颜色由蓝变黄；若【ruò】孔【kǒng】内有绿色【sè】，则表明孔内液体【tǐ】未【wèi】混匀；请充分混合。

说明：

1.由于现有条件及科学技术【shù】水【shuǐ】平尚不能【néng】对所有【yǒu】供【gòng】货商提供的所有原料进【jìn】行全面的鉴定与分【fèn】析，本产品可【kě】能存在一定的质量【liàng】技术风险。

2.最终的实验结果与试剂的有效性、实验者的【de】相关操作以及当时的实【shí】验环境密【mì】切相关【guān】，请务必【bì】准备充足的标本【běn】备【bèi】份【fèn】。

3.不同批次的同一【yī】产品可能会有少许差别，如：检【jiǎn】测限、灵敏度以【yǐ】及显色时间等，请依【yī】据【jù】试剂盒内【nèi】说明书进行实【shí】验【yàn】操作，网【wǎng】站电子版说明【míng】书仅作参考。

4.只有全部【bù】使用本试【shì】剂盒配【pèi】套试剂才能保证【zhèng】检测效果，不能混用其他制造商的产【chǎn】品【pǐn】。只【zhī】有严格遵守本试【shì】剂盒的实验说明【míng】才会得到【dào】最【zuì】佳的检测结果。