本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒用于【yú】体【tǐ】外【wài】定量检【jiǎn】测血清、血浆、组织【zhī】匀浆及相关液体【tǐ】样本【běn】中【zhōng】人ⅡA组磷脂酶A2(PLA2G2A)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标【biāo】准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量【liàng】正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂【jì】盒【hé】提供【gòng】的检测范【fàn】围内【nèi】，实【shí】验过程中【zhōng】直接取50μL样本上样即可。当【dāng】有部分样本值超过最大标准品浓【nóng】度时，可【kě】用样本【běn】稀释液【yè】将标【biāo】本进行适当稀【xī】释后再进行【háng】实验。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰箱中取【qǔ】出的浓缩洗涤液可能有结【jié】晶，属于【yú】正常现象；放置【zhì】室温，轻摇均【jun1】匀【yún】，待结晶溶解【jiě】后再配【pèi】置洗涤液【yè】。可将20ml浓缩洗涤液用蒸【zhēng】馏水或去离子水【shuǐ】稀释配置成400ml工作浓度的洗涤液，未用【yòng】完的放回4℃

3.20×洗涤缓冲【chōng】液的稀【xī】释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液【yè】加19份蒸馏水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹【jiá】心法酶联免【miǎn】疫【yì】吸附试【shì】验（ELISA）。往预先【xiān】包被【bèi】人ⅡA组磷脂酶A2(PLA2G2A)捕获抗体的包被微孔中，依次加入【rù】标【biāo】本、标准品、HRP标【biāo】记的检【jiǎn】测抗体【tǐ】，经过温育并洗涤。用底物TMB显色，TMB在过【guò】氧化物酶的催化下转化成蓝【lán】色，并在【zài】酸的作用下转化成最终的黄色【sè】。颜色的深浅和样品【pǐn】中的人ⅡA组磷脂【zhī】酶【méi】A2(PLA2G2A)呈正【zhèng】相【xiàng】关【guān】。用酶标仪在【zài】450nm 波长下测【cè】定【dìng】吸光【guāng】度（OD 值），计算样品浓度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪（450nm）

2.高精度加样器及【jí】枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清：将收集于血清分离【lí】管的全血标本在【zài】室温放置【zhì】2小时或4℃过【guò】夜，然【rán】后1000×g离心20 分钟，取【qǔ】上清即可，或将上清【qīng】置于【yú】-20℃或-80℃保存，但应避【bì】免反复【fù】冻融。

2.血【xuè】浆：用EDTA或肝素作【zuò】为抗凝剂采【cǎi】集标本【běn】，并将标本在采集后的30分【fèn】钟内于9-21℃ 1000×g离心15分钟，取上【shàng】清即可【kě】检测，或【huò】将上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应避【bì】免反复【fù】冻融。

3.组织匀浆【jiāng】：用预【yù】冷【lěng】的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中【zhōng】裂解的【de】红细【xì】胞会影响【xiǎng】测量结果），称重后将组织剪碎。将剪【jiǎn】碎【suì】的【de】组织与对【duì】应【yīng】体【tǐ】积【jī】的PBS（一般【bān】按【àn】1:9的重量体积比，比如1g的组织样【yàng】品对【duì】应9mL的【de】PBS，具体体积可根据实验需要适当调【diào】整，并做【zuò】好记录【lù】。推荐在PBS中加入蛋白酶抑【yì】制剂）加入玻璃【lí】匀浆【jiāng】器中，于冰上充分研磨。为【wéi】了进一步【bù】裂解组织【zhī】细胞，可以对匀浆液进【jìn】行超声破碎【suì】，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分【fèn】钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清：请1000×g离【lí】心20分钟，取上【shàng】清即【jí】可检测，或将上清置【zhì】于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻【dòng】融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样【yàng】品保存【cún】：样【yàng】品收集后若【ruò】在1周内进行检测的可【kě】保存于4℃，若不能及时检测，请按一【yī】次使用量分装【zhuāng】，冻存于-20℃（1个【gè】月内检测【cè】），或【huò】-80℃（6个月内检测），避免【miǎn】反【fǎn】复冻融，标本溶血会影响最后检测结果，因此溶【róng】血标【biāo】本不宜进行此项检测。

注意事项：

1.严格按照规定的时间和温度【dù】进行温育以保证准【zhǔn】确结果。所有试剂都必【bì】须【xū】在使用前【qián】达到【dào】室【shì】温9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2.洗【xǐ】板不【bú】正确可以导致【zhì】不准确的结果【guǒ】。在加入底物前确保尽量【liàng】吸干孔内液体【tǐ】。温育过程中【zhōng】不要让微孔干【gàn】燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物显【xiǎn】色液应呈无【wú】色或很浅的颜【yán】色，已经【jīng】变蓝的【de】底物液不能使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反应试剂不能接【jiē】触漂白溶剂【jì】或漂白溶【róng】剂所散发的强【qiáng】烈【liè】气【qì】体。任何【hé】漂白成【chéng】分【fèn】都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性【xìng】。

9.不能使用过期产品。

10.如果可能传播疾【jí】病，所有的样【yàng】品都【dōu】应管理好，按照规【guī】定的【de】程序处理样品和检【jiǎn】测【cè】装置。

操作步骤：

1．从【cóng】室温平衡60min后的铝箔袋中【zhōng】取出【chū】所需板【bǎn】条，剩余板条用自封袋【dài】密【mì】封放回4℃。

2．设置标准【zhǔn】品孔和样本孔，标准品孔各加不【bú】同【tóng】浓度的标准【zhǔn】品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，标准品【pǐn】孔【kǒng】和【hé】样本【běn】孔中每孔加【jiā】入辣根过氧【yǎng】化物酶（HRP）标记的检测抗【kàng】体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴【yù】锅或恒温箱温育60min。

5．弃去液体，吸水【shuǐ】纸上拍干，每孔加满【mǎn】洗涤液（350μL），静【jìng】置1min，甩去洗【xǐ】涤【dí】液，吸水纸【zhǐ】上【shàng】拍干，如此重复洗板5次（也可【kě】用洗【xǐ】板机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每【měi】孔【kǒng】加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处【chù】测定【dìng】各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中【zhōng】，以标准品【pǐn】浓度作横【héng】坐标，对应OD值作纵坐标【biāo】，绘制出标【biāo】准品线性回归曲线，按曲【qǔ】线方程【chéng】计算各样本浓度值。

（此图仅供参考）

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性：板内变异【yì】系数小于10% ，板【bǎn】间变【biàn】异系数小于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为【wéi】了避免交叉感染，配置不同浓度标准品【pǐn】、上样、加不同试【shì】剂都需要【yào】更换枪【qiāng】头。另外不同试剂【jì】请分别【bié】使用不同【tóng】的移液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后的【de】显色底物在上板前应为无色，请避【bì】光【guāng】保存；假如微【wēi】孔板【bǎn】后【hòu】，将【jiāng】由物色变成不同深度的【de】蓝色。

5.终止液上板顺【shùn】序应同【tóng】显色底物上【shàng】板顺序一致；加【jiā】入终止液后，孔内颜色由蓝变黄【huáng】；若【ruò】孔内有绿色，则表明孔【kǒng】内【nèi】液体未混【hún】匀；请充分混合【hé】。

说明：

1.由于现有条件及【jí】科学技术水平尚不能对【duì】所有供货商【shāng】提供【gòng】的所【suǒ】有原料进【jìn】行全面的鉴定【dìng】与分析【xī】，本产【chǎn】品可能存在一定的质量技术风险。

2.最终的【de】实验【yàn】结果与【yǔ】试剂的有效性、实验者的【de】相关操作以【yǐ】及当时【shí】的实【shí】验环境密【mì】切【qiē】相关，请务必准备充足的标本备份。

3.不【bú】同批次的同一【yī】产品可能会【huì】有少许差别，如【rú】：检测【cè】限、灵【líng】敏度【dù】以及显色时间等，请依据试剂盒内说明书【shū】进行【háng】实验操作【zuò】，网站电子版说明书仅作参考【kǎo】。

4.只有全部使用本【běn】试剂【jì】盒配套试剂才能保证【zhèng】检测效果，不能混【hún】用其他【tā】制造商的产品【pǐn】。只有严格遵守【shǒu】本试剂盒的【de】实【shí】验说明才会得到最【zuì】佳【jiā】的检【jiǎn】测结果。