本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试剂盒【hé】用于体外定量检【jiǎn】测血清、血浆、组织【zhī】匀浆及相关液体样【yàng】本【běn】中人Ⅰ型胶原【yuán】α1(COL1a1)的含量【liàng】。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品【pǐn】浓度【dù】依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量【liàng】正常【cháng】标本检验，标本的正常【cháng】浓度值均在【zài】试剂盒【hé】提供的检【jiǎn】测范围内，实验过程中直【zhí】接取50μL样【yàng】本上【shàng】样即可。当有部分样本值超【chāo】过最大标准品浓度时，可【kě】用样本稀释液【yè】将标本【běn】进行适当稀释【shì】后再进【jìn】行实验。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰箱中取出的浓缩洗涤液可【kě】能有结【jié】晶，属于【yú】正常【cháng】现象；放置室【shì】温，轻摇均匀，待结晶溶【róng】解【jiě】后再配【pèi】置洗涤液。可将20ml浓缩【suō】洗【xǐ】涤液用蒸【zhēng】馏水或去离子水稀释配置成400ml工作浓度的【de】洗涤液【yè】，未用完的【de】放回4℃

3.20×洗【xǐ】涤【dí】缓【huǎn】冲液的【de】稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

实验原理：

试剂盒采用双抗体一步夹心【xīn】法酶联免疫吸【xī】附试验（ELISA）。往预先包被【bèi】人【rén】Ⅰ型胶原【yuán】α1(COL1a1)捕获抗体的包被【bèi】微孔【kǒng】中【zhōng】，依次加【jiā】入标本【běn】、标准品、HRP标【biāo】记【jì】的检测抗体，经过温【wēn】育【yù】并洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催【cuī】化下转化成【chéng】蓝色，并在酸的作用下【xià】转化【huà】成最终的黄色【sè】。颜色的深浅和样品中的人【rén】Ⅰ型胶【jiāo】原α1(COL1a1)呈正相【xiàng】关。用酶标仪在450nm 波长下测【cè】定吸光度（OD 值），计算样品浓【nóng】度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪（450nm）

2.高精【jīng】度加【jiā】样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血【xuè】清【qīng】：将收集于【yú】血清分离管的全血【xuè】标本在室温放【fàng】置2小时或【huò】4℃过夜，然后【hòu】1000×g离心20 分钟，取上清即可，或【huò】将上清置于-20℃或-80℃保存，但应【yīng】避免反复冻【dòng】融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为【wéi】抗凝【níng】剂【jì】采集标本，并将标本在【zài】采【cǎi】集后的【de】30分钟内于9-21℃ 1000×g离心【xīn】15分钟【zhōng】，取上清【qīng】即可【kě】检测，或将上清置于-20℃或【huò】-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的【de】PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗【xǐ】组织【zhī】，去除【chú】残留血液（匀浆【jiāng】中【zhōng】裂解【jiě】的红细胞会影响测量结果），称重后【hòu】将组织剪碎。将剪碎【suì】的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重【chóng】量【liàng】体积比，比如1g的组织样品【pǐn】对应9mL的PBS，具体【tǐ】体积可根【gēn】据实验需【xū】要适当【dāng】调整【zhěng】，并做【zuò】好记录。推荐【jiàn】在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀【yún】浆器中，于冰上【shàng】充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以【yǐ】对匀浆液进行超声破【pò】碎，或反复冻融。最后将匀浆液于【yú】5000×g离【lí】心5~10分【fèn】钟，取【qǔ】上清【qīng】检【jiǎn】测【cè】。

4.细胞培养【yǎng】物上清：请1000×g离心【xīn】20分钟，取上清即可检【jiǎn】测，或将上清置【zhì】于-20℃或【huò】-80℃保存，但应【yīng】避免反复冻【dòng】融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品【pǐn】保【bǎo】存：样品收集后若在1周内进行检【jiǎn】测的可【kě】保存于4℃，若不能及时检测【cè】，请【qǐng】按一【yī】次使用量【liàng】分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个【gè】月【yuè】内检测【cè】），避免【miǎn】反复冻融，标本溶血会影响最后检【jiǎn】测结果，因此溶血【xuè】标本不宜进行此项检测。

注意事项：

1.严格按【àn】照规定的时间和温度进行温育【yù】以【yǐ】保证准确结果。所有试【shì】剂都必须在使用前达到室温9-21℃。使【shǐ】用后立即冷【lěng】藏保存【cún】试【shì】剂。

2.洗板不【bú】正【zhèng】确可以导致不准确的【de】结果。在【zài】加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微【wēi】孔干燥【zào】掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物显色液应呈无【wú】色或很浅的颜色【sè】，已经【jīng】变蓝的【de】底物液【yè】不能使【shǐ】用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反应试剂【jì】不能接【jiē】触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气【qì】体。任何【hé】漂【piāo】白成分【fèn】都【dōu】会破【pò】坏试剂盒中反应试剂【jì】的生物活性【xìng】。

9.不能使用过期产品。

10.如【rú】果可能【néng】传播疾病，所有的样品都应管理【lǐ】好，按照规定的【de】程【chéng】序处理样【yàng】品和检测装【zhuāng】置。

操作步骤：

1．从室温平【píng】衡60min后的铝箔袋中取出所需【xū】板条【tiáo】，剩余板【bǎn】条用自封袋密封放【fàng】回【huí】4℃。

2．设置标【biāo】准品孔和样本孔，标准品【pǐn】孔各加不同浓度的标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除【chú】空【kōng】白孔外【wài】，标准品孔【kǒng】和样本孔中【zhōng】每孔加入辣根【gēn】过氧化物酶【méi】（HRP）标记的【de】检测抗体100μL，用封板膜封【fēng】住【zhù】反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5．弃去液体，吸【xī】水纸上【shàng】拍干【gàn】，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩【shuǎi】去洗涤【dí】液【yè】，吸水纸上拍干，如【rú】此重【chóng】复洗板5次（也可用洗【xǐ】板机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入终止液【yè】50μL，15min内，在450nm波长【zhǎng】处测定【dìng】各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐【zuò】标，对应【yīng】OD值作纵坐【zuò】标，绘制【zhì】出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓【nóng】度值。

（此图仅供参考）

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性：板内变异系数小【xiǎo】于10% ，板【bǎn】间【jiān】变异系【xì】数小于【yú】15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了【le】避免交叉感染，配置不同浓度标准品【pǐn】、上样、加不同试剂都需【xū】要更换枪头。另外【wài】不同试【shì】剂请分别使【shǐ】用不同的移液【yè】槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后的显色底【dǐ】物在上板前应为【wéi】无色，请【qǐng】避光保存；假如微孔板【bǎn】后，将由物色变【biàn】成不【bú】同【tóng】深【shēn】度的蓝色。

5.终止【zhǐ】液上板顺序【xù】应同显色【sè】底【dǐ】物上板【bǎn】顺序一【yī】致；加入终止液后，孔【kǒng】内颜色由【yóu】蓝变黄；若孔内有绿色，则表明孔内液体未混匀；请充分【fèn】混合。

说明：

1.由于现有条件及科学技术水平尚不能对所有【yǒu】供货【huò】商提供【gòng】的【de】所有原料【liào】进行【háng】全面的【de】鉴定【dìng】与分析，本产品可能存在一定的质量【liàng】技术风险【xiǎn】。

2.最终的【de】实【shí】验结【jié】果与【yǔ】试剂的有效性、实验者的【de】相关操作以及当时的实验环境密切相关，请务【wù】必准备【bèi】充足的【de】标【biāo】本备份。

3.不同批次的同一产品可能【néng】会有少许差【chà】别【bié】，如：检测【cè】限、灵敏度以【yǐ】及显【xiǎn】色时间等，请【qǐng】依据试剂盒内说明书进行实验操作，网站电子版说明书【shū】仅【jǐn】作参考。

4.只有【yǒu】全【quán】部【bù】使【shǐ】用本试【shì】剂【jì】盒配套试剂才能保证【zhèng】检测效果，不能混用其他制造商的产品。只【zhī】有严格【gé】遵守本试剂盒【hé】的实验【yàn】说明才会得到最佳的检测结果。