本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

本试【shì】剂盒用于体外【wài】定量检测血清、血浆、组织【zhī】匀浆及相【xiàng】关液体【tǐ】样本中人【rén】4-羟基壬烯醛(4-HNE)的含量【liàng】。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓度依次为【wéi】：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量【liàng】正常标本检验，标【biāo】本的正【zhèng】常浓度【dù】值【zhí】均【jun1】在试剂盒【hé】提供的检测范围内，实验过程【chéng】中直接取50μL样本上样即可。当有【yǒu】部分【fèn】样【yàng】本【běn】值超过最大标准品浓度【dù】时，可用样本【běn】稀释【shì】液将标本进行适当稀释【shì】后再进行实验。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从【cóng】冰【bīng】箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶【jīng】，属【shǔ】于正【zhèng】常现【xiàn】象；放【fàng】置室温，轻摇均匀，待结晶溶解后再【zài】配置洗【xǐ】涤液。可将【jiāng】20ml浓缩洗涤液用蒸馏水或【huò】去离子【zǐ】水稀释配置【zhì】成400ml工作浓度的洗【xǐ】涤液，未用【yòng】完的放回4℃

3.20×洗涤缓冲【chōng】液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份【fèn】20×洗涤缓冲【chōng】液【yè】加19份蒸馏水。

实验原理：

试剂【jì】盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试【shì】验（ELISA）。往预先包【bāo】被人【rén】4-羟【qiǎng】基壬烯醛(4-HNE)捕获抗【kàng】体的包被微孔中，依次加【jiā】入【rù】标本、标准品、HRP标记的【de】检【jiǎn】测抗体，经过温育并洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化【huà】物【wù】酶的催【cuī】化下转【zhuǎn】化成蓝色，并在酸的作用下转化成最【zuì】终的黄色。颜【yán】色【sè】的深【shēn】浅和样品中【zhōng】的人4-羟【qiǎng】基壬烯【xī】醛(4-HNE)呈正【zhèng】相关。用酶标仪在450nm 波长下测【cè】定【dìng】吸光【guāng】度（OD 值），计算【suàn】样品浓度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪（450nm）

2.高【gāo】精【jīng】度加样【yàng】器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清【qīng】：将【jiāng】收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过【guò】夜，然后1000×g离【lí】心20 分钟，取上清即可，或将上【shàng】清【qīng】置于-20℃或-80℃保存，但应避免反【fǎn】复冻融【róng】。

2.血【xuè】浆：用EDTA或肝素【sù】作为抗凝剂采集标本，并【bìng】将【jiāng】标本在采集【jí】后的30分钟内于9-21℃ 1000×g离【lí】心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于【yú】-20℃或-80℃保存，但【dàn】应避免反【fǎn】复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除【chú】残留血【xuè】液（匀浆【jiāng】中【zhōng】裂解【jiě】的红细胞会影响【xiǎng】测【cè】量结果），称重后将组织剪碎【suì】。将【jiāng】剪碎【suì】的【de】组【zǔ】织与对应体积【jī】的PBS（一般按【àn】1:9的重量体积比，比【bǐ】如1g的【de】组【zǔ】织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据【jù】实验需要适当调整，并做好【hǎo】记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制【zhì】剂）加入玻【bō】璃【lí】匀浆器中【zhōng】，于冰【bīng】上充分研磨。为了进一步裂解【jiě】组织细胞，可以对匀浆液进【jìn】行超声破碎【suì】，或反复冻融。最【zuì】后将匀【yún】浆液【yè】于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上【shàng】清：请1000×g离心【xīn】20分钟【zhōng】，取上清【qīng】即可检测【cè】，或将上清【qīng】置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融【róng】。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保存【cún】：样品收【shōu】集【jí】后若在1周内进行检测的可保存于【yú】4℃，若不【bú】能及时【shí】检测，请【qǐng】按【àn】一次【cì】使【shǐ】用量分装，冻【dòng】存【cún】于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月【yuè】内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响最后检测结【jié】果，因【yīn】此溶血标本不【bú】宜进行此项检测【cè】。

注意事项：

1.严【yán】格按照规【guī】定【dìng】的时间和温度进行温【wēn】育以保证准确结【jié】果。所有试剂都必须在使用前达到室温9-21℃。使【shǐ】用【yòng】后立即冷藏保【bǎo】存试【shì】剂。

2.洗板不正确【què】可以导致不准【zhǔn】确的【de】结果。在加【jiā】入底物前确保尽量吸干孔内【nèi】液【yè】体。温育【yù】过程中不要让【ràng】微孔干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底【dǐ】物显色液【yè】应呈【chéng】无色或【huò】很浅的颜【yán】色，已经变蓝的底物【wù】液不能使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任【rèn】何反应试【shì】剂不【bú】能接触【chù】漂白溶剂【jì】或漂白溶剂所【suǒ】散发【fā】的【de】强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中【zhōng】反应试剂的生物活性。

9.不能使用过期产品。

10.如果【guǒ】可能传播疾病，所有的样品都应【yīng】管理【lǐ】好，按【àn】照规【guī】定的程序【xù】处理样品【pǐn】和检测装置。

操作步骤：

1．从室【shì】温平衡【héng】60min后的铝箔【bó】袋中取出所【suǒ】需【xū】板条【tiáo】，剩余板【bǎn】条用自封袋密封放回4℃。

2．设置标【biāo】准品【pǐn】孔和样本孔，标准品【pǐn】孔各加不同【tóng】浓【nóng】度的标准【zhǔn】品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白【bái】孔外，标准品【pǐn】孔和样本孔中每孔加入【rù】辣根过氧【yǎng】化物酶（HRP）标记的检测【cè】抗体100μL，用封板【bǎn】膜【mó】封住反应孔，37℃水浴锅或恒【héng】温箱温育60min。

5．弃去【qù】液体，吸【xī】水纸上拍干【gàn】，每孔加满洗涤【dí】液（350μL），静【jìng】置1min，甩去洗涤【dí】液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板【bǎn】机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔【kǒng】加【jiā】入终止【zhǐ】液50μL，15min内，在【zài】450nm波长【zhǎng】处测定【dìng】各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲：在【zài】Excel工作【zuò】表【biǎo】中【zhōng】，以标准品浓度作横坐标【biāo】，对应OD值【zhí】作【zuò】纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲【qǔ】线【xiàn】方程计算各样本浓度值。

（此图仅供参考）

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性：板【bǎn】内变异系数【shù】小【xiǎo】于10% ，板【bǎn】间变异系数小于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避免交叉感染【rǎn】，配置【zhì】不同浓度【dù】标准【zhǔn】品、上样、加不同试剂都需要更换枪【qiāng】头。另外不同试剂请【qǐng】分【fèn】别【bié】使用不同的移液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混【hún】合后【hòu】的显色底物在上板前应【yīng】为无色，请避光保存；假如微孔板后【hòu】，将由物色【sè】变成不同深【shēn】度【dù】的蓝色【sè】。

5.终止【zhǐ】液上板顺序应同显色底物上板顺序【xù】一致；加入终止【zhǐ】液后，孔内颜色由蓝变黄；若【ruò】孔内有绿【lǜ】色，则表明孔内【nèi】液【yè】体未混匀【yún】；请【qǐng】充分混合。

说明：

1.由【yóu】于现有条件及【jí】科学技术水平尚不【bú】能对所有【yǒu】供货商提供的【de】所有原【yuán】料进【jìn】行全【quán】面的鉴定【dìng】与分【fèn】析，本产品可能【néng】存在一定的质量技术风险。

2.最终的实验结果与试剂的有效性、实【shí】验者的相关操【cāo】作以及当【dāng】时的实【shí】验环境密切【qiē】相关，请【qǐng】务必【bì】准备充【chōng】足的【de】标本【běn】备份。

3.不【bú】同批次【cì】的同一产品可能【néng】会有少许【xǔ】差别，如：检测【cè】限、灵敏度以及显色【sè】时间等，请依据试剂盒内说明书【shū】进行实验操作，网站电【diàn】子版说明【míng】书仅作参考【kǎo】。

4.只有全部使用本试剂盒配套试剂才能保证【zhèng】检测【cè】效果，不能混用其他制造商的产品。只有【yǒu】严【yán】格遵【zūn】守本试剂盒【hé】的实验说明才会得到【dào】最【zuì】佳【jiā】的检【jiǎn】测结【jié】果。