本试剂盒用于体外定量【liàng】检测血清【qīng】、血浆、组织匀浆【jiāng】及相关液【yè】体样本中鸡α1-酸性糖蛋白(a1AGP)的含【hán】量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品【pǐn】浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过【guò】大量正常标【biāo】本检【jiǎn】验，标本的正常浓度值均在试剂盒【hé】提供的检测范【fàn】围内，实验【yàn】过程【chéng】中直接取50μL样本上【shàng】样即可。当【dāng】有部分样本【běn】值【zhí】超过最大标准品浓度时，可用样本【běn】稀释液将标本【běn】进行适【shì】当稀释【shì】后再【zài】进行实验。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰【bīng】箱中【zhōng】取出的浓【nóng】缩洗涤【dí】液可能有【yǒu】结晶，属于【yú】正常现象；放【fàng】置室温，轻摇【yáo】均匀，待结晶溶解后再【zài】配置【zhì】洗涤液【yè】。可将20ml浓缩【suō】洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释配置成400ml工【gōng】作浓【nóng】度的洗涤液，未用完的放【fàng】回4℃

3.20×洗【xǐ】涤缓冲液的稀【xī】释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤【dí】缓冲液加【jiā】19份蒸馏水。

实验原理：

试剂盒【hé】采用双抗体一【yī】步夹心法酶联免【miǎn】疫【yì】吸附试验（ELISA）。往预先包被鸡α1-酸性糖【táng】蛋白(a1AGP)捕获抗体的包被微孔中，依次【cì】加【jiā】入【rù】标本、标【biāo】准品【pǐn】、HRP标记的【de】检测抗体，经过温育并洗涤。用底物TMB显【xiǎn】色，TMB在过氧【yǎng】化物酶的催化下转【zhuǎn】化成蓝色，并【bìng】在【zài】酸的作【zuò】用下转化成最终的黄色。颜色的【de】深浅【qiǎn】和样品中的鸡α1-酸性【xìng】糖【táng】蛋白【bái】(a1AGP)呈正【zhèng】相【xiàng】关。用酶标仪在450nm 波长下【xià】测定吸光【guāng】度【dù】（OD 值），计算样品浓度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪（450nm）

2.高精度加样【yàng】器及枪头【tóu】：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清：将收【shōu】集于血清分离管的全【quán】血标本在室【shì】温放置2小时或4℃过夜【yè】，然后【hòu】1000×g离心【xīn】20 分钟，取【qǔ】上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免【miǎn】反复冻【dòng】融。

2.血浆：用【yòng】EDTA或肝素作为抗【kàng】凝【níng】剂采集标本，并【bìng】将标本在采集后【hòu】的30分钟内于【yú】9-21℃ 1000×g离心15分钟，取上清【qīng】即【jí】可检测，或【huò】将【jiāng】上清【qīng】置于-20℃或-80℃保存，但【dàn】应避免反复冻融。

3.组织【zhī】匀浆：用预冷【lěng】的【de】PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血【xuè】液（匀浆中裂解的红细胞会【huì】影响测量结果），称【chēng】重后将组织剪碎。将剪碎的组织【zhī】与对应【yīng】体积的PBS（一【yī】般按1:9的重量体积【jī】比，比如1g的组织样品对【duì】应9mL的PBS，具体体积可【kě】根据实【shí】验需要适当调【diào】整【zhěng】，并做【zuò】好记录。推荐【jiàn】在PBS中加入蛋【dàn】白酶【méi】抑制剂）加入玻璃匀【yún】浆器中【zhōng】，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反【fǎn】复【fù】冻融【róng】。最【zuì】后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清【qīng】检测。

4.细胞培【péi】养物上清：请1000×g离心20分【fèn】钟，取上清即可【kě】检测【cè】，或将上清【qīng】置于-20℃或-80℃保存，但应避免【miǎn】反复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品【pǐn】保存【cún】：样品收集后若在1周【zhōu】内进【jìn】行【háng】检【jiǎn】测【cè】的可保存【cún】于4℃，若不能及时检测，请按一次【cì】使用量分装，冻存于【yú】-20℃（1个【gè】月内检测），或-80℃（6个月内【nèi】检测），避免反复冻融，标本溶血【xuè】会影响最后检测结果，因【yīn】此溶血【xuè】标【biāo】本不【bú】宜进行此项检【jiǎn】测。

注意事项：

1.严格【gé】按【àn】照规定的时间和温度进【jìn】行温育以【yǐ】保证【zhèng】准确结果。所有试剂都必须在使用【yòng】前【qián】达到室温9-21℃。使用后立【lì】即冷藏保【bǎo】存试剂。

2.洗板不正确可以导致不【bú】准确【què】的结果。在加入【rù】底物前确保尽【jìn】量吸干孔内液【yè】体。温育过程【chéng】中不【bú】要让微孔【kǒng】干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物显色液应呈无色【sè】或很【hěn】浅的颜色，已【yǐ】经【jīng】变蓝的底物液【yè】不能使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反应试剂不能接触漂白溶剂【jì】或漂【piāo】白【bái】溶剂所散发【fā】的【de】强烈气体。任何漂【piāo】白成分都【dōu】会破坏【huài】试剂盒【hé】中反应试剂的生物活性【xìng】。

9.不能使用过期产品。

10.如【rú】果可能传播疾【jí】病，所【suǒ】有的样品都【dōu】应管【guǎn】理好，按照规定的程序【xù】处理样品和检测装【zhuāng】置。

操作步骤：

1．从室温平衡60min后的铝箔袋【dài】中【zhōng】取出所【suǒ】需【xū】板条，剩余板条用自封袋密封【fēng】放【fàng】回4℃。

2．设置标准【zhǔn】品孔和样本【běn】孔，标准品孔各【gè】加不同【tóng】浓度的标【biāo】准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白【bái】孔【kǒng】外，标准品孔和样本孔中每孔加入【rù】辣根过【guò】氧【yǎng】化物酶（HRP）标记的检测抗体【tǐ】100μL，用封板膜封住【zhù】反应孔，37℃水【shuǐ】浴锅或恒温箱【xiāng】温育60min。

5．弃去液体，吸水纸上拍干，每【měi】孔加满【mǎn】洗涤液【yè】（350μL），静置1min，甩去洗涤【dí】液，吸【xī】水【shuǐ】纸上拍【pāi】干，如此【cǐ】重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入终止液【yè】50μL，15min内【nèi】，在450nm波长处测【cè】定各【gè】孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应【yīng】OD值作纵坐【zuò】标，绘【huì】制出【chū】标准品线性回归曲线【xiàn】，按曲【qǔ】线【xiàn】方【fāng】程计算各样本【běn】浓【nóng】度值。

（此图仅供参考）

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性【xìng】：板内变异系数小于10% ，板【bǎn】间变异系【xì】数小于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避免交叉感染，配【pèi】置不同浓度【dù】标【biāo】准【zhǔn】品、上样、加不同【tóng】试剂都需要更换枪头。另外不同试剂请分别使【shǐ】用【yòng】不同的移【yí】液槽【cáo】。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后的【de】显【xiǎn】色底【dǐ】物在上板【bǎn】前应为无色【sè】，请避光保存；假【jiǎ】如微孔板后，将由【yóu】物色【sè】变成不【bú】同深度的蓝色。

5.终止液上【shàng】板顺序应同显色底【dǐ】物上板顺序一致；加入终【zhōng】止【zhǐ】液后，孔内颜色由蓝变黄；若孔【kǒng】内【nèi】有【yǒu】绿色，则表明孔内液体【tǐ】未混匀；请充分【fèn】混合。

说明：

1.由【yóu】于现有条件【jiàn】及科学技术水平尚不能对所【suǒ】有【yǒu】供货商提供的所有原【yuán】料进【jìn】行【háng】全面的鉴定【dìng】与分析【xī】，本产品可【kě】能存在【zài】一定的质量技术风险。

2.最【zuì】终的【de】实验结果与试剂【jì】的有效性、实验者的【de】相关操作以【yǐ】及当时的实验环【huán】境密切相关，请务必准备充足【zú】的【de】标【biāo】本备份。

3.不同批次的同一产品可【kě】能【néng】会有少许差别，如：检测限、灵【líng】敏度以及显色时间等【děng】，请依【yī】据试【shì】剂盒内说【shuō】明书进行实验【yàn】操【cāo】作，网【wǎng】站电【diàn】子版说明书仅作参考。

4.只有全部使用本试剂【jì】盒配套试剂【jì】才能保证检测效果，不【bú】能混【hún】用【yòng】其他【tā】制造商的产【chǎn】品。只有严格遵守本试剂【jì】盒的实验说明才会【huì】得到最佳的【de】检测结果。