本试剂盒用于体外定量【liàng】检测血清、血【xuè】浆、组织匀浆【jiāng】及相关液体样本【běn】中大鼠Ⅱ型【xíng】前胶原氨基端原肽(PIINP)的【de】含量【liàng】。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

试剂盒组成：

大鼠Ⅱ型前胶原氨基端原肽(PIINP)试剂盒备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准【zhǔn】品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过【guò】大量正常标【biāo】本【běn】检验，标本的正常浓【nóng】度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中直接取50μL样【yàng】本上样即可【kě】。当有【yǒu】部分样本值超【chāo】过【guò】最大标准品浓度时，可用样本稀【xī】释液【yè】将标本进行适当稀释【shì】后【hòu】再进【jìn】行实验。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从【cóng】冰箱中取出的【de】浓缩洗涤【dí】液可能有结【jié】晶，属于正常现【xiàn】象；放置【zhì】室温，轻摇均匀，待结晶溶解后再配置洗涤【dí】液。可将20ml浓缩【suō】洗【xǐ】涤液用蒸馏【liú】水【shuǐ】或【huò】去离子水稀释配置成400ml工作浓【nóng】度的【de】洗涤液，未用【yòng】完的放回4℃

3.20×洗涤缓冲液的稀释【shì】：蒸馏水【shuǐ】按【àn】1：20稀释【shì】，即1份20×洗【xǐ】涤缓冲液加19份蒸馏水。

实验原理：

试剂盒采用【yòng】双抗体一步夹【jiá】心【xīn】法酶联【lián】免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠Ⅱ型前胶原【yuán】氨基端【duān】原肽(PIINP)捕【bǔ】获抗体【tǐ】的【de】包被微孔中，依次加入标本、标【biāo】准品、HRP标记的【de】检测【cè】抗体，经过【guò】温【wēn】育并洗涤【dí】。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成【chéng】蓝色，并【bìng】在酸的作用下转【zhuǎn】化【huà】成最【zuì】终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠Ⅱ型【xíng】前【qián】胶原【yuán】氨【ān】基端原肽【tài】(PIINP)呈【chéng】正相关。用酶标仪在【zài】450nm 波长下测【cè】定吸光度（OD 值），计【jì】算样品浓度【dù】。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪（450nm）

2.高精度加样【yàng】器及枪【qiāng】头【tóu】：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清：将收集于【yú】血清分离【lí】管的全血【xuè】标【biāo】本在室温放置2小时或4℃过夜【yè】，然后【hòu】1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上【shàng】清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应避免反复【fù】冻融。

2.血浆：用【yòng】EDTA或肝素作为抗凝剂采【cǎi】集标本，并将标本在【zài】采集后的30分钟内于9-21℃ 1000×g离【lí】心【xīn】15分钟【zhōng】，取上清【qīng】即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但【dàn】应避免【miǎn】反复冻融。

3.组织匀【yún】浆：用预冷【lěng】的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留【liú】血液【yè】（匀浆中裂解的红细胞会【huì】影响测量结果），称【chēng】重后将组织【zhī】剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积【jī】比，比【bǐ】如1g的组织样【yàng】品对应9mL的PBS，具体体积可根据【jù】实验需要适当调整，并做好【hǎo】记录。推荐在【zài】PBS中【zhōng】加入蛋白酶抑【yì】制剂【jì】）加入玻【bō】璃匀浆器中，于冰上充分【fèn】研磨。为了【le】进一【yī】步【bù】裂解【jiě】组织【zhī】细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复【fù】冻融。最【zuì】后【hòu】将匀浆液于5000×g离心5~10分【fèn】钟【zhōng】，取上【shàng】清检测。

4.细胞培养物上【shàng】清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于【yú】-20℃或【huò】-80℃保【bǎo】存，但【dàn】应避免反复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保存：样品【pǐn】收【shōu】集后若在1周内【nèi】进行检测的可【kě】保【bǎo】存于4℃，若不能及时检【jiǎn】测，请按一次【cì】使【shǐ】用量分装【zhuāng】，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复【fù】冻【dòng】融【róng】，标本【běn】溶血会影【yǐng】响【xiǎng】最后检测结果，因此溶血标本【běn】不宜进行此项检测。

注意事项：

1.严格按【àn】照【zhào】规定的【de】时间和【hé】温度进行温育以保【bǎo】证准【zhǔn】确结【jié】果。所有试剂都必须在使用前达到室【shì】温9-21℃。使【shǐ】用后立即冷藏保存试剂。

2.洗【xǐ】板不正确【què】可以导致不准确的结【jié】果。在加入【rù】底物前【qián】确保尽量吸干孔内【nèi】液【yè】体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物显【xiǎn】色液应呈无色或很浅的颜色，已【yǐ】经变蓝的【de】底物液【yè】不【bú】能使用【yòng】。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反应试剂不能接触漂【piāo】白溶剂或【huò】漂【piāo】白溶剂所【suǒ】散发【fā】的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中【zhōng】反应【yīng】试【shì】剂的生物活性。

9.不能使用过期产品。

10.如果可能传播疾病【bìng】，所有的【de】样品都【dōu】应管【guǎn】理好【hǎo】，按照规定的程序处【chù】理样【yàng】品和检测装置。

操作步骤：

1．从室【shì】温【wēn】平衡60min后的铝箔袋中【zhōng】取出所需板条，剩余板条用【yòng】自封袋密封放回4℃。

2．设置标准品孔和样本【běn】孔【kǒng】，标准品孔各加不【bú】同浓度的标【biāo】准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔【kǒng】外，标准品孔和样【yàng】本孔中【zhōng】每孔加入【rù】辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板【bǎn】膜封住反【fǎn】应孔，37℃水【shuǐ】浴锅或恒温【wēn】箱温育60min。

5．弃去液体，吸【xī】水【shuǐ】纸上拍干，每【měi】孔【kǒng】加满【mǎn】洗【xǐ】涤液【yè】（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水【shuǐ】纸【zhǐ】上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机【jī】洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入终止液【yè】50μL，15min内，在【zài】450nm波【bō】长处测定各孔的OD值。

实验结果计算：

绘【huì】制【zhì】标准曲线：在Excel工作表【biǎo】中【zhōng】，以标准【zhǔn】品浓度作横坐标，对【duì】应OD值作纵坐标，绘制【zhì】出标准品线性回归曲【qǔ】线，按曲线方【fāng】程计算【suàn】各样本浓度值。

（此图仅供参考）

大鼠Ⅱ型前胶原氨基端原肽(PIINP)试剂盒性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性：板【bǎn】内变【biàn】异系数小于【yú】10% ，板间变异系数【shù】小于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避免交叉感【gǎn】染，配置【zhì】不【bú】同浓度标准品【pǐn】、上样、加【jiā】不同【tóng】试【shì】剂都需要更换枪头【tóu】。另外不同试【shì】剂请分别使用不同的移液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后的显色底【dǐ】物在上板前应为无【wú】色【sè】，请避光保存；假如【rú】微孔板后【hòu】，将由物色变成不同深【shēn】度【dù】的蓝色。

5.终止液上板【bǎn】顺【shùn】序应同【tóng】显色底物上【shàng】板顺序【xù】一致【zhì】；加入【rù】终止液后，孔内颜色由【yóu】蓝变黄；若孔内有绿色，则表明孔内【nèi】液体未混匀；请充分混合。

说明：

1.由【yóu】于【yú】现有条件及科学技术水【shuǐ】平尚不【bú】能【néng】对所有供货商提供的所有原料进行全面的鉴【jiàn】定与【yǔ】分析，本产品可【kě】能存在一定【dìng】的质量技【jì】术【shù】风险。

2.最终的实验结果与试剂的有效【xiào】性、实验者的相关操作以【yǐ】及当【dāng】时【shí】的【de】实验【yàn】环境密切相【xiàng】关，请务【wù】必准备充【chōng】足的标本备份。

3.不同批次的同一产品【pǐn】可能【néng】会有少许【xǔ】差别，如：检测限、灵敏度以及显色时间等，请依【yī】据试【shì】剂盒内说【shuō】明书【shū】进行实验操作，网站电子【zǐ】版说【shuō】明书【shū】仅作【zuò】参考。

4.只有全部使用本试【shì】剂【jì】盒配套试剂才能保【bǎo】证检测效果，不能混用其他制造商的产品。只有严格【gé】遵守【shǒu】本试剂盒的【de】实【shí】验说明才会得【dé】到最佳的检【jiǎn】测【cè】结果。