本试【shì】剂盒【hé】用【yòng】于体外定量检测血清【qīng】、血【xuè】浆、组织匀浆及相关液【yè】体样本中小鼠Ⅴ型胶原(COL5)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

小鼠Ⅴ型胶原(COL5)试剂盒组成：

备注：

1. (96T/48T)打开包装后请【qǐng】及【jí】时检【jiǎn】查所有物品是否齐全【quán】。

2. 标【biāo】准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量正常【cháng】标本检【jiǎn】验，标本的正常浓【nóng】度值均在试剂盒提【tí】供的检测范围内，实【shí】验过程【chéng】中直接取50μL样【yàng】本上样即可。当有【yǒu】部【bù】分样本值【zhí】超过大【dà】标准品浓【nóng】度时，可用【yòng】样本稀【xī】释液将标【biāo】本进行适当稀释后再进行实【shí】验。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从【cóng】冰【bīng】箱中取出的浓缩【suō】洗涤液可【kě】能有结晶【jīng】，属于正常现象；放置【zhì】室温【wēn】，轻摇均【jun1】匀，待结晶溶解后再配置洗涤液。可将20ml浓缩洗涤【dí】液用蒸馏水【shuǐ】或去离子水稀释配【pèi】置成【chéng】400ml工作浓【nóng】度的【de】洗涤液，未用完的【de】放回4℃

3.20×洗涤缓冲液的【de】稀释：蒸馏水按1：20稀释【shì】，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸【zhēng】馏水【shuǐ】。

实验原理：

试【shì】剂盒采用【yòng】双抗体一步夹心法酶联【lián】免【miǎn】疫【yì】吸附试【shì】验(ELISA)。往预【yù】先包被小鼠Ⅴ型【xíng】胶原(COL5)捕【bǔ】获抗体【tǐ】的包被【bèi】微孔中，依次加入【rù】标本、标准品、HRP标记【jì】的检测抗体，经过温育并洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并【bìng】在酸【suān】的【de】作用下【xià】转化【huà】成终的。颜【yán】色的【de】深浅和样品中【zhōng】的小鼠Ⅴ型胶原(COL5)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定【dìng】吸【xī】光度(OD 值)，计算【suàn】样品【pǐn】浓度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪(450nm)

2.高精度加样器及【jí】枪头【tóu】：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清：将收【shōu】集【jí】于血清分离【lí】管的全血标本在室【shì】温放【fàng】置2小时或【huò】4℃过夜，然后【hòu】1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或【huò】-80℃保存【cún】，但应【yīng】避免反【fǎn】复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为【wéi】抗【kàng】凝【níng】剂【jì】采集标【biāo】本，并将标【biāo】本在采集后的30分钟内于9-21℃ 1000×g离心15分钟，取上【shàng】清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应避免反复冻融。

3.组【zǔ】织匀【yún】浆【jiāng】：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗【xǐ】组【zǔ】织，去除残留血【xuè】液【yè】(匀浆中【zhōng】裂解的【de】红细胞会影响测量结果)，称重后将组织剪碎。将剪碎【suì】的【de】组织与对应体积的PBS(一【yī】般按1:9的【de】重量体积比，比如1g的【de】组【zǔ】织样品对【duì】应9mL的PBS，具体体积可根据【jù】实验需要适当调整【zhěng】，并做好【hǎo】记【jì】录。推【tuī】荐在PBS中加入蛋白酶【méi】抑制剂)加【jiā】入【rù】玻璃匀浆器【qì】中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或【huò】反复【fù】冻融。后【hòu】将匀浆液【yè】于5000×g离心5~10分钟，取【qǔ】上清检测。

4.细胞【bāo】培养物上【shàng】清：请1000×g离【lí】心20分钟【zhōng】，取上清即【jí】可检测，或【huò】将上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应避免反复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保【bǎo】存：样品【pǐn】收集【jí】后若【ruò】在【zài】1周内【nèi】进【jìn】行检测的可保存于4℃，若【ruò】不能及时检【jiǎn】测，请按一次使用量分装，冻【dòng】存【cún】于-20℃(1个月内检测【cè】)，或-80℃(6个月【yuè】内检【jiǎn】测)，避免反复冻融【róng】，标本溶血会影响后检测结【jié】果，因此溶血【xuè】标本不【bú】宜进行此项检测。

注意事项：

1.严格【gé】按照【zhào】规【guī】定的时间和温度进行温育以保证准【zhǔn】确【què】结【jié】果。所有【yǒu】试剂都【dōu】必【bì】须在使用前达到【dào】室温9-21℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2.洗板不正确可以导致不准确【què】的结【jié】果。在加入【rù】底物前【qián】确保尽量吸干【gàn】孔【kǒng】内液体。温育过程【chéng】中不要让微【wēi】孔【kǒng】干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物显色液应呈【chéng】无色或很浅【qiǎn】的【de】颜【yán】色，已经变蓝的底物【wù】液不【bú】能使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反【fǎn】应试剂不能接触漂白溶【róng】剂或漂【piāo】白【bái】溶剂所散发的强烈【liè】气体。任何【hé】漂【piāo】白成分都会破坏试剂盒中【zhōng】反应试剂的生物活性。

9.不能使用过期产品。

10.如【rú】果可能传【chuán】播疾病【bìng】，所有【yǒu】的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检【jiǎn】测装置。

小鼠Ⅴ型胶原(COL5)试剂盒操作步骤：

1．从室温平衡60min后的铝箔【bó】袋【dài】中取出所需【xū】板条，剩余【yú】板条用自封袋密封放【fàng】回【huí】4℃。

2．设置标准品孔和样本孔，标【biāo】准品孔各加【jiā】不【bú】同浓【nóng】度的标准【zhǔn】品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空【kōng】白孔【kǒng】外，标【biāo】准品孔和【hé】样【yàng】本孔中每孔加入辣【là】根【gēn】过氧化物酶(HRP)标【biāo】记的检测抗体100μL，用封板膜【mó】封住反应孔，37℃水【shuǐ】浴锅或恒温箱【xiāng】温育【yù】60min。

5．弃去液体，吸水纸上拍干，每【měi】孔加满洗涤【dí】液【yè】(350μL)，静置【zhì】1min，甩去洗涤【dí】液【yè】，吸【xī】水纸上拍干，如【rú】此重复洗板5次(也可【kě】用洗【xǐ】板机洗板)。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔【kǒng】加【jiā】入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表【biǎo】中【zhōng】，以【yǐ】标准品浓度作横【héng】坐标，对【duì】应OD值作【zuò】纵【zòng】坐【zuò】标，绘制出标准品线性【xìng】回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度【dù】值【zhí】。

(此图仅供参考)

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异【yì】系【xì】数【shù】小【xiǎo】于【yú】15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避免【miǎn】交叉【chā】感染，配置不同浓【nóng】度标准品、上样、加不【bú】同【tóng】试剂都需【xū】要更换枪头。另外不同试剂【jì】请分别使用【yòng】不同的移液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后【hòu】的显色【sè】底物在上板前应为【wéi】无色，请避光保存【cún】；假如【rú】微孔【kǒng】板后，将由物色变【biàn】成不【bú】同深度的【de】蓝色。

5.终止液【yè】上板顺序应同显色【sè】底物上板顺序一【yī】致【zhì】；加入【rù】终止液【yè】后，孔内颜【yán】色由蓝变黄；若孔内有绿色，则表明【míng】孔内液体未混匀；请充分混合【hé】。

说明：

1.由【yóu】于现有【yǒu】条件【jiàn】及科学【xué】技【jì】术水平尚不【bú】能对所有【yǒu】供货【huò】商提供的所有【yǒu】原料进【jìn】行全面的鉴定与分析，本产品可能存在一定【dìng】的质量技术风险。

2.终的实验结果与试【shì】剂的有效性、实验【yàn】者【zhě】的相关操作【zuò】以及当时的实验【yàn】环【huán】境密切相关，请【qǐng】务必准备充【chōng】足的标【biāo】本备份。

3.不同批次的同【tóng】一产【chǎn】品可【kě】能【néng】会有少许【xǔ】差别，如【rú】：检测限、灵敏度以及显色时间等，请依据试剂【jì】盒【hé】内【nèi】说明书进行实验操作，网站电子版说明【míng】书仅作参考。

4.只有【yǒu】全部使用本试剂盒配【pèi】套试剂才能【néng】保证检【jiǎn】测效果【guǒ】，不能混用其他【tā】商的【de】产品。只有严【yán】格遵守本试剂盒的【de】实验【yàn】说明才会得到佳的检测结果。