本试剂盒用【yòng】于体【tǐ】外定量检测血【xuè】清、血浆【jiāng】、组【zǔ】织【zhī】匀浆及【jí】相关液体【tǐ】样本中牛1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

牛1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)试剂盒组成：

备注：

1. (96T/48T)打开包【bāo】装后请及【jí】时检【jiǎn】查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓【nóng】度依【yī】次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经【jīng】过大量【liàng】正常标本检【jiǎn】验，标本的正常浓度值【zhí】均在试剂盒提供的检测范围【wéi】内，实验过程中直接取50μL样本上样【yàng】即可。当有部分样【yàng】本值超过大【dà】标准品浓度时【shí】，可用样【yàng】本稀【xī】释液将标本进行【háng】适当稀释后【hòu】再进行【háng】实验。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从【cóng】冰箱中取出的浓【nóng】缩【suō】洗【xǐ】涤【dí】液可能有结晶，属于正常现象；放置【zhì】室【shì】温，轻摇【yáo】均匀，待结晶溶解后再配置洗涤液【yè】。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水【shuǐ】或去【qù】离子水稀释配置【zhì】成400ml工【gōng】作浓度的洗【xǐ】涤【dí】液，未用完的放回【huí】4℃

3.20×洗涤缓冲液的稀释【shì】：蒸馏水按1：20稀【xī】释，即1份20×洗涤【dí】缓冲【chōng】液【yè】加19份蒸【zhēng】馏水。

实验原理：

试【shì】剂【jì】盒采用双抗体一【yī】步夹心法酶联免疫吸【xī】附试验(ELISA)。往预【yù】先包被牛1,4,5-三磷酸肌【jī】醇(IP3)捕获抗体的包被微孔中，依次加入【rù】标【biāo】本、标准品、HRP标记【jì】的检【jiǎn】测抗体，经过温【wēn】育并洗涤。用底【dǐ】物TMB显色【sè】，TMB在过氧化物【wù】酶的【de】催化下转化成【chéng】蓝色，并【bìng】在酸的作用下转化成终的。颜色的深浅和样品中的牛1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)呈【chéng】正相【xiàng】关。用酶标仪【yí】在【zài】450nm 波长下测定吸光度(OD 值)，计算样品浓度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪(450nm)

2.高精度【dù】加【jiā】样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清【qīng】：将收集于血清分离【lí】管的全血【xuè】标本在室温放【fàng】置2小时或4℃过夜，然【rán】后1000×g离心【xīn】20 分【fèn】钟，取上清即可，或【huò】将上清置于-20℃或-80℃保存，但【dàn】应避免反复【fù】冻融。

2.血浆：用【yòng】EDTA或肝素作为抗凝剂采集标【biāo】本，并【bìng】将标本在采集后的30分钟内于9-21℃ 1000×g离心【xīn】15分钟，取上清即可检测，或【huò】将上清置于-20℃或【huò】-80℃保【bǎo】存，但应避免反【fǎn】复冻融。

3.组织匀【yún】浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组【zǔ】织，去【qù】除残留【liú】血【xuè】液(匀【yún】浆【jiāng】中【zhōng】裂解的红细胞会影响测量结果)，称【chēng】重后【hòu】将【jiāng】组织剪碎。将剪碎【suì】的组织【zhī】与对应体积的【de】PBS(一般按1:9的重【chóng】量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根【gēn】据实验需【xū】要适当调【diào】整，并【bìng】做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑【yì】制剂)加入【rù】玻璃匀浆器【qì】中，于冰上【shàng】充分【fèn】研磨。为【wéi】了【le】进一步裂解组织细胞，可以对【duì】匀浆液进行【háng】超声破【pò】碎，或反复冻融。后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养【yǎng】物上清【qīng】：请1000×g离心20分钟【zhōng】，取【qǔ】上【shàng】清即可检【jiǎn】测，或将上清置于-20℃或【huò】-80℃保存，但应避免反复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保存：样【yàng】品收集后若在1周【zhōu】内【nèi】进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量【liàng】分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃(6个月内检测)，避免反复【fù】冻融，标本溶血会影响检测【cè】结【jié】果【guǒ】，因此溶血【xuè】标【biāo】本不宜进【jìn】行【háng】此项【xiàng】检测。

注意事项：

1.严格【gé】按照规【guī】定的时间和温度进行温育以【yǐ】保【bǎo】证准确结果。所【suǒ】有试剂【jì】都必须在使用前达到室温9-21℃。使用【yòng】后立即冷藏保存试【shì】剂。

2.洗板不正确可以导致不【bú】准确的【de】结果。在加入底物【wù】前确保尽【jìn】量【liàng】吸干孔内液【yè】体【tǐ】。温育过程中不要让【ràng】微【wēi】孔干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物显【xiǎn】色液应呈无【wú】色或很浅的颜色，已经变蓝的底物【wù】液不【bú】能使【shǐ】用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反【fǎn】应试剂不能接触漂白溶剂【jì】或漂白溶剂所散【sàn】发【fā】的【de】强烈气体。任何【hé】漂白成分都会【huì】破坏【huài】试【shì】剂盒中反应试剂的生物活性。

9.不能使用过期产品。

10.如果【guǒ】可能传播疾病，所有的样品都应管理【lǐ】好，按照规【guī】定的程【chéng】序【xù】处理样品【pǐn】和检测装置【zhì】。

牛1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)试剂盒操作步骤：

1．从室温平衡60min后的铝箔袋中取【qǔ】出【chū】所需板条【tiáo】，剩【shèng】余板【bǎn】条用自封袋密封放【fàng】回4℃。

2．设置标准【zhǔn】品孔和样本【běn】孔，标准品孔【kǒng】各加不同浓度的标【biāo】准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空【kōng】白孔外，标准【zhǔn】品孔和样本孔中每孔加入【rù】辣【là】根过【guò】氧化物酶(HRP)标记的检测【cè】抗体100μL，用封板膜【mó】封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱【xiāng】温【wēn】育【yù】60min。

5．弃去液【yè】体【tǐ】，吸【xī】水【shuǐ】纸上【shàng】拍【pāi】干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍【pāi】干，如此重复洗【xǐ】板5次(也可用洗板机洗板)。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔【kǒng】加入【rù】终止液【yè】50μL，15min内，在【zài】450nm波长【zhǎng】处测定各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制【zhì】标准曲线：在【zài】Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵【zòng】坐【zuò】标，绘制出标准品【pǐn】线性回归曲线，按曲【qǔ】线【xiàn】方【fāng】程计算【suàn】各样本浓度值。

(此图仅供参考)

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性【xìng】：板内变【biàn】异系【xì】数小于10% ，板间【jiān】变异系数【shù】小于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避免交叉感染【rǎn】，配置【zhì】不同浓【nóng】度标准品、上样【yàng】、加不同试剂【jì】都【dōu】需要更换枪头。另【lìng】外不同试剂请分别使用不【bú】同的移液槽【cáo】。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混【hún】合后的显色底物【wù】在上【shàng】板【bǎn】前应为无色，请避光保存；假如微孔板后，将由物色【sè】变成不【bú】同深度的蓝色。

5.终止液上【shàng】板顺【shùn】序【xù】应同显色【sè】底物上板顺序一致；加入终止液后，孔内【nèi】颜色由蓝变黄；若孔【kǒng】内有绿【lǜ】色【sè】，则表明【míng】孔内液体未混匀；请【qǐng】充分混合。

说明：

1.由于现有条件及【jí】科学技术水平尚不能对所有供货商提【tí】供的所有原料进行全【quán】面的鉴定与分【fèn】析【xī】，本【běn】产品可【kě】能存在一定【dìng】的【de】质量技术风险。

2.的实验结果【guǒ】与【yǔ】试剂【jì】的有效性、实验者的相关【guān】操作以及当时的实验环境【jìng】密切【qiē】相关【guān】，请【qǐng】务必准备充足的【de】标本备份。

3.不同批次的同一产品可【kě】能会有少许【xǔ】差别，如：检测【cè】限、灵敏度以及显【xiǎn】色【sè】时间【jiān】等，请依据试【shì】剂【jì】盒内说明书进行实验操作【zuò】，网站电子版【bǎn】说明【míng】书仅作参考。

4.只有全部使【shǐ】用本试剂盒配套试剂才能保证检测效果，不能【néng】混用其他【tā】商的【de】产品。只【zhī】有【yǒu】严格遵【zūn】守本试剂盒的实验说明才会得到【dào】佳的检测【cè】结果【guǒ】。