本【běn】试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组【zǔ】织【zhī】匀浆【jiāng】及相关液【yè】体样本中大鼠【shǔ】I型胶原【yuán】(Col-I)的含【hán】量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

大鼠I型胶原(Col-I)试剂盒组成：

备注：

1. (96T/48T)打开包装后请及【jí】时检查所【suǒ】有物品【pǐn】是否齐全【quán】。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量【liàng】正常标本检验，标本的【de】正【zhèng】常浓度【dù】值【zhí】均在试剂盒提供的检测范围内【nèi】，实验过【guò】程中直接取50μL样本上样即可。当【dāng】有部分样本【běn】值超过大标准品浓度【dù】时，可【kě】用样本稀释液将标本进行适【shì】当稀【xī】释【shì】后再进行实验。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能【néng】有【yǒu】结【jié】晶【jīng】，属于正常现象；放置室温【wēn】，轻摇均匀，待结晶溶解【jiě】后再配置洗涤【dí】液。可将20ml浓缩【suō】洗涤液用【yòng】蒸馏【liú】水或去【qù】离子水稀释配【pèi】置成400ml工作浓度【dù】的洗涤液，未用完的放回【huí】4℃

3.20×洗涤缓冲液的稀释【shì】：蒸馏水按【àn】1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份【fèn】蒸馏水【shuǐ】。

实验原理：

试剂盒【hé】采【cǎi】用双抗体一【yī】步夹心【xīn】法酶联【lián】免疫吸附试验【yàn】(ELISA)。往预【yù】先【xiān】包被大鼠I型胶原【yuán】(Col-I)捕获抗体的包被微孔中，依次【cì】加入标【biāo】本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤。用底物TMB显【xiǎn】色，TMB在【zài】过氧化【huà】物酶的催【cuī】化【huà】下转化成【chéng】蓝色，并在酸【suān】的作用下转【zhuǎn】化成终的。颜【yán】色的【de】深浅和样品中的大鼠I型胶原(Col-I)呈【chéng】正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定【dìng】吸光度【dù】(OD 值)，计算样【yàng】品浓度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪(450nm)

2.高【gāo】精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清【qīng】：将收集于血清分离管的【de】全血标本【běn】在室温【wēn】放置2小时【shí】或4℃过夜，然后1000×g离【lí】心20 分【fèn】钟【zhōng】，取上清即可，或将上清置于-20℃或【huò】-80℃保存【cún】，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素【sù】作为抗凝剂采集【jí】标本，并将【jiāng】标本【běn】在【zài】采集【jí】后的30分钟内【nèi】于9-21℃ 1000×g离心15分钟，取上【shàng】清【qīng】即可检测【cè】，或【huò】将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避【bì】免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的【de】PBS (0.01M, pH=7.4)冲【chōng】洗组织，去除【chú】残留血液【yè】(匀浆中裂【liè】解的红细【xì】胞会影响测量结果【guǒ】)，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一【yī】般按1:9的重量体积【jī】比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据【jù】实验【yàn】需【xū】要【yào】适当调整，并【bìng】做好记录【lù】。推荐【jiàn】在PBS中加入蛋白酶抑【yì】制剂)加入玻璃【lí】匀浆器【qì】中，于冰上充分【fèn】研磨。为了【le】进一步裂解【jiě】组织细胞【bāo】，可以【yǐ】对匀浆液进行【háng】超声破【pò】碎，或反复冻融。后将【jiāng】匀浆液于【yú】5000×g离心5~10分钟【zhōng】，取上【shàng】清检测【cè】。

4.细胞培养物上【shàng】清：请1000×g离心20分钟，取上【shàng】清即可检测【cè】，或将上清【qīng】置于-20℃或-80℃保存，但应避免【miǎn】反【fǎn】复冻【dòng】融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保【bǎo】存：样品收集后【hòu】若在1周内进行检【jiǎn】测的可【kě】保存于4℃，若不能及时检测，请按【àn】一【yī】次使用【yòng】量分【fèn】装【zhuāng】，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃(6个月内检测)，避免【miǎn】反复冻【dòng】融，标本溶血会【huì】影响后检测结果，因此溶血【xuè】标本不宜【yí】进行此项检测【cè】。

注意事项：

1.严格按照规【guī】定的时间【jiān】和温度进【jìn】行【háng】温育【yù】以【yǐ】保证准确结【jié】果。所【suǒ】有试剂都必须在使用前达到室温9-21℃。使用后【hòu】立即冷【lěng】藏保存试剂。

2.洗板不正【zhèng】确可以【yǐ】导致不【bú】准确【què】的结果。在加入【rù】底物前确保尽量吸【xī】干孔内液体。温育过程中不要让微孔干【gàn】燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物显【xiǎn】色【sè】液【yè】应呈无色或很浅的颜色，已经【jīng】变蓝【lán】的底物液不能使用【yòng】。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何【hé】反【fǎn】应试剂不能接触【chù】漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任【rèn】何漂白【bái】成分都会破坏试剂盒【hé】中反应试剂的生物活【huó】性【xìng】。

9.不能使用过期产品。

10.如果【guǒ】可能传播疾病，所有的样品都应管理【lǐ】好，按照规定的程序处理【lǐ】样品和检测【cè】装置。

大鼠I型胶原(Col-I)试剂盒操作步骤：

1．从室温平衡【héng】60min后的铝箔袋中取出所【suǒ】需板【bǎn】条，剩【shèng】余板条用自封袋【dài】密封放回4℃。

2．设置标准品孔【kǒng】和【hé】样本孔，标准品孔各加不同【tóng】浓度的标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，标准品孔和样本孔【kǒng】中【zhōng】每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记【jì】的检测抗体100μL，用封板【bǎn】膜封住反【fǎn】应孔，37℃水浴【yù】锅【guō】或【huò】恒温【wēn】箱【xiāng】温育60min。

5．弃去液体，吸【xī】水【shuǐ】纸上拍【pāi】干，每孔【kǒng】加满洗涤液(350μL)，静【jìng】置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如【rú】此【cǐ】重复【fù】洗【xǐ】板5次(也可【kě】用洗板【bǎn】机洗板)。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每【měi】孔【kǒng】加入终止液50μL，15min内，在【zài】450nm波长处测【cè】定各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲【qǔ】线【xiàn】：在【zài】Excel工【gōng】作表中【zhōng】，以标准品浓度【dù】作横【héng】坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标【biāo】准品线性回归曲线【xiàn】，按曲线方程计算各样本浓度值。

(此图仅供参考)

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性【xìng】：板内变异系数小于10% ，板间变【biàn】异系数小【xiǎo】于【yú】15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避免交【jiāo】叉感染，配置【zhì】不同浓度【dù】标准品、上样、加不同试【shì】剂都需【xū】要更换枪头。另外不同试剂请分别【bié】使用不【bú】同的移液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后【hòu】的显色底【dǐ】物在【zài】上板前应为无色，请避光【guāng】保存；假如微孔板【bǎn】后【hòu】，将由物色变成不同深度的蓝【lán】色【sè】。

5.终【zhōng】止液【yè】上【shàng】板顺序应同【tóng】显色底物上板顺序一致；加【jiā】入终止液后【hòu】，孔【kǒng】内颜色由【yóu】蓝变【biàn】黄；若孔内有绿色，则表明孔内液【yè】体未混匀；请充分混【hún】合。

说明：

1.由于现有条【tiáo】件【jiàn】及科学技术【shù】水平【píng】尚不能对所有供货商【shāng】提供【gòng】的【de】所有原料进行全面【miàn】的鉴定与分析，本产品可能存【cún】在一定的质量【liàng】技术风险。

2.终的实验【yàn】结果与试剂的有【yǒu】效性【xìng】、实【shí】验者【zhě】的相关操作以【yǐ】及【jí】当时的实验环境密切相关，请务必准备【bèi】充足的标本【běn】备份。

3.不同批次的同【tóng】一产【chǎn】品可【kě】能会【huì】有少【shǎo】许【xǔ】差别，如：检测限、灵敏度【dù】以及显色时间等，请依据试剂盒内说明书进行实验操作，网【wǎng】站电子【zǐ】版说明书仅【jǐn】作参考。

4.只有全【quán】部使用【yòng】本试剂【jì】盒配套试剂才能保证【zhèng】检测效果，不能【néng】混【hún】用其【qí】他【tā】商的产品。只有严格遵守【shǒu】本试剂盒的实验说明才会得到佳的【de】检测结果【guǒ】。