本试剂盒用于体外定量检测血【xuè】清、血浆【jiāng】、组织匀【yún】浆及相关液体样【yàng】本【běn】中【zhōng】人Bcl-2相关X蛋白(Bax)的【de】含【hán】量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

人Bcl-2相关X蛋白(Bax)试剂盒组成：

备注：

1. (96T/48T)打开包装后【hòu】请【qǐng】及时检查所有物【wù】品是否齐全【quán】。

2. 标准品【pǐn】浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大【dà】量正常标本检验【yàn】，标本的正【zhèng】常浓度值均在试剂盒提供【gòng】的检测范围【wéi】内，实验过程中直接取【qǔ】50μL样本上样即可【kě】。当【dāng】有部分【fèn】样本值超过【guò】大标准品浓度时【shí】，可【kě】用样【yàng】本稀释液【yè】将标本进行【háng】适当稀释后再【zài】进行实验。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从【cóng】冰【bīng】箱中取出的浓缩洗涤液可能有【yǒu】结晶，属于正常【cháng】现象【xiàng】；放置室温，轻【qīng】摇均匀【yún】，待结晶溶解后再配【pèi】置洗涤液。可【kě】将20ml浓【nóng】缩【suō】洗涤液【yè】用【yòng】蒸馏水或去离【lí】子水稀释配置成400ml工作浓度的洗涤液，未【wèi】用完的放【fàng】回4℃

3.20×洗涤缓冲液的稀释【shì】：蒸馏水按1：20稀释【shì】，即1份20×洗涤【dí】缓冲【chōng】液加19份蒸馏水。

实验原理：

试剂盒【hé】采用【yòng】双抗体一【yī】步夹心法酶联【lián】免疫吸附试验(ELISA)。往预先【xiān】包【bāo】被人Bcl-2相关X蛋白(Bax)捕获抗【kàng】体的包【bāo】被【bèi】微孔中，依次加入标本、标准【zhǔn】品、HRP标记的检测抗体，经过温育【yù】并洗涤。用底物TMB显色【sè】，TMB在过氧化物酶的催化【huà】下转化成蓝【lán】色，并在【zài】酸的作用下转化成终的【de】。颜色的深浅和样品中【zhōng】的人【rén】Bcl-2相【xiàng】关X蛋【dàn】白【bái】(Bax)呈【chéng】正相关。用酶【méi】标【biāo】仪在450nm 波【bō】长下测定吸光度(OD 值)，计算样品浓【nóng】度【dù】。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪(450nm)

2.高【gāo】精度加样器【qì】及枪头【tóu】：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血【xuè】清：将收集于血清分【fèn】离管的全血标本在室温放置【zhì】2小【xiǎo】时或【huò】4℃过夜，然【rán】后1000×g离心20 分钟，取上清即【jí】可，或将上清置于-20℃或-80℃保存【cún】，但应避免【miǎn】反复【fù】冻融。

2.血浆：用【yòng】EDTA或肝素作为【wéi】抗凝剂【jì】采集标本，并将【jiāng】标【biāo】本【běn】在采【cǎi】集【jí】后的30分钟内于9-21℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测【cè】，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避【bì】免【miǎn】反复冻融。

3.组织匀浆：用预【yù】冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组【zǔ】织【zhī】，去除残留血液(匀浆中裂解【jiě】的红细【xì】胞会影响【xiǎng】测量结果)，称重后将组织剪碎【suì】。将剪碎【suì】的【de】组织【zhī】与对应体积【jī】的【de】PBS(一般【bān】按【àn】1:9的重量体积【jī】比【bǐ】，比如1g的组【zǔ】织【zhī】样品对【duì】应【yīng】9mL的PBS，具体体积可根据实验【yàn】需要适当调整，并做好记录【lù】。推荐【jiàn】在PBS中加入蛋白酶抑制剂【jì】)加入玻璃匀浆器中，于冰上【shàng】充【chōng】分研磨。为【wéi】了进【jìn】一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。后将匀【yún】浆液于【yú】5000×g离心5~10分钟，取上清检【jiǎn】测。

4.细【xì】胞培【péi】养物上清：请1000×g离【lí】心20分钟【zhōng】，取上清即可检测，或将上清【qīng】置于-20℃或-80℃保存，但【dàn】应避免反复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样【yàng】品保【bǎo】存：样品收集后【hòu】若在1周内进行【háng】检测的可保存于【yú】4℃，若不【bú】能及时【shí】检测，请按一次使用【yòng】量分装【zhuāng】，冻存于-20℃(1个月【yuè】内检测)，或-80℃(6个月【yuè】内检测)，避免反复冻融，标本溶【róng】血会影响后检测结果，因【yīn】此【cǐ】溶血标本不宜进行此项检测。

注意事项：

1.严格按【àn】照规定【dìng】的时间【jiān】和【hé】温度进行【háng】温育【yù】以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达【dá】到室温9-21℃。使用后【hòu】立即冷【lěng】藏保存试剂【jì】。

2.洗板不【bú】正确可以导【dǎo】致不【bú】准确的结果。在加【jiā】入底物前【qián】确保尽量吸干孔【kǒng】内液体。温【wēn】育过程中【zhōng】不要让微孔【kǒng】干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物显色【sè】液应呈无色或很浅的【de】颜色【sè】，已【yǐ】经【jīng】变蓝的底物液不能使【shǐ】用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反应试剂【jì】不能接触漂【piāo】白溶【róng】剂或漂【piāo】白【bái】溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反【fǎn】应【yīng】试剂的【de】生物【wù】活性。

9.不能使用过期产品。

10.如果可能传播疾病，所有的【de】样品【pǐn】都【dōu】应管理好，按照规【guī】定的程序处【chù】理样品和检测装【zhuāng】置。

人Bcl-2相关X蛋白(Bax)试剂盒操作步骤：

1．从室【shì】温【wēn】平衡60min后的铝箔袋中取出所【suǒ】需板条【tiáo】，剩余板条用自封袋【dài】密封放【fàng】回4℃。

2．设置【zhì】标准品孔和样本孔，标准品【pǐn】孔【kǒng】各加不【bú】同浓度的标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除【chú】空白孔外，标准品【pǐn】孔和样本孔中【zhōng】每孔【kǒng】加入辣根【gēn】过【guò】氧【yǎng】化物酶【méi】(HRP)标记的检测【cè】抗体100μL，用封板膜封【fēng】住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱【xiāng】温育60min。

5．弃【qì】去【qù】液体，吸水【shuǐ】纸上【shàng】拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置【zhì】1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此【cǐ】重复洗板5次(也可用洗【xǐ】板【bǎn】机洗板)。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入【rù】终止【zhǐ】液50μL，15min内【nèi】，在450nm波长处测定各孔的OD值【zhí】。

实验结果计算：

绘【huì】制标准曲线：在【zài】Excel工作表中，以标【biāo】准品浓度【dù】作横坐标，对【duì】应OD值作【zuò】纵坐【zuò】标，绘制出标【biāo】准品线性回归曲线，按曲【qǔ】线方程计算各【gè】样本【běn】浓度值。

(此图仅供参考)

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性【xìng】：板内变异系数【shù】小于10% ，板间变异【yì】系数小于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了【le】避免交叉感染，配置不【bú】同浓度【dù】标准品【pǐn】、上样、加【jiā】不同【tóng】试剂都【dōu】需要更换枪头。另外不同试剂请分别使用【yòng】不同的移液【yè】槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混【hún】合后的显【xiǎn】色底物在【zài】上板前【qián】应为无色，请避光保存；假如微孔板后，将【jiāng】由【yóu】物色变成不同【tóng】深度的蓝色【sè】。

5.终止液上【shàng】板顺序应同显色底物上【shàng】板顺【shùn】序一【yī】致；加入【rù】终【zhōng】止液后，孔内颜【yán】色由蓝变【biàn】黄【huáng】；若孔内有绿【lǜ】色，则表【biǎo】明孔内液体未混匀；请充分混合。

说明：

1.由于现有条件及【jí】科学【xué】技术【shù】水平尚不能对所有供【gòng】货商提【tí】供的所有原【yuán】料进行全面的鉴【jiàn】定【dìng】与分【fèn】析，本产品可能存在【zài】一定的【de】质量技术风险。

2.终的实验结果【guǒ】与试【shì】剂的有效【xiào】性、实验【yàn】者的【de】相关【guān】操作以及当【dāng】时的实验环境密【mì】切【qiē】相关，请务必准备充足的标本备份。

3.不同批次的同【tóng】一【yī】产品可能【néng】会有少许差别，如：检测限、灵【líng】敏度以【yǐ】及显色【sè】时间等，请依据试剂盒内说明【míng】书进行实验操作，网【wǎng】站电子版说【shuō】明【míng】书仅作参考。

4.只有全部使用本试剂盒【hé】配套试【shì】剂才【cái】能保证检测效果，不能【néng】混用其他商的产品【pǐn】。只有【yǒu】严格遵守本【běn】试剂盒的【de】实验【yàn】说明才【cái】会得到佳的检测【cè】结果。