本试剂盒用于体外【wài】定【dìng】量检测血清、血浆、组【zǔ】织匀浆及【jí】相关液体【tǐ】样本中小鼠Ⅲ型前胶原(PCIII)的【de】含量【liàng】。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

小鼠Ⅲ型前胶原(PCIII)试剂盒组成：

备注：

1. (96T/48T)打开包装后【hòu】请及时检查所有【yǒu】物品是否【fǒu】齐【qí】全。

2. 标准品浓度【dù】依【yī】次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过【guò】大量正常标本检【jiǎn】验，标本的正常浓度值均【jun1】在试【shì】剂盒提供【gòng】的检测范【fàn】围【wéi】内，实【shí】验过程中直接取【qǔ】50μL样本上样即可【kě】。当有【yǒu】部分样【yàng】本值超过大标准品浓度时，可用样本稀释【shì】液将标本进【jìn】行适当稀释后再【zài】进行实验【yàn】。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从【cóng】冰箱中【zhōng】取出的浓缩洗涤液可【kě】能有结晶，属于正【zhèng】常【cháng】现象；放置【zhì】室温，轻摇【yáo】均匀，待结【jié】晶溶解后【hòu】再配置洗【xǐ】涤液。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏【liú】水或去离子水【shuǐ】稀【xī】释配置成400ml工作浓度的洗涤液，未用【yòng】完【wán】的放回4℃

3.20×洗涤缓冲液的稀释【shì】：蒸馏水按【àn】1：20稀释【shì】，即1份20×洗涤缓冲液加【jiā】19份蒸【zhēng】馏水。

实验原理：

试剂盒采用【yòng】双抗体一步【bù】夹心法酶【méi】联免【miǎn】疫吸附试验(ELISA)。往预先【xiān】包【bāo】被小鼠【shǔ】Ⅲ型前胶原(PCIII)捕获【huò】抗体的包被【bèi】微孔中【zhōng】，依【yī】次加【jiā】入标本【běn】、标准品、HRP标【biāo】记的检测抗体，经过温育并洗涤。用【yòng】底物TMB显色，TMB在过氧【yǎng】化物酶的催化【huà】下转化成【chéng】蓝色，并在酸的作用下【xià】转化成终的。颜色的深浅【qiǎn】和样品【pǐn】中的【de】小【xiǎo】鼠【shǔ】Ⅲ型前胶原(PCIII)呈正相关。用酶标【biāo】仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值)，计算样品浓度【dù】。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪(450nm)

2.高精度加样器及【jí】枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清：将收集【jí】于血清分【fèn】离【lí】管的全血标【biāo】本在【zài】室【shì】温【wēn】放置2小时或4℃过夜【yè】，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或【huò】将上清置【zhì】于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作【zuò】为抗凝【níng】剂采集标本，并【bìng】将标本在采集后【hòu】的30分钟内于【yú】9-21℃ 1000×g离心15分钟，取【qǔ】上【shàng】清即【jí】可检测，或【huò】将上【shàng】清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应避免反复【fù】冻融【róng】。

3.组织匀浆：用【yòng】预【yù】冷的【de】PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液(匀浆中裂解的红【hóng】细胞会影响测量结果)，称【chēng】重后将组织剪碎。将剪【jiǎn】碎【suì】的组织【zhī】与对应体积的PBS(一【yī】般按1:9的【de】重量体积【jī】比【bǐ】，比如1g的组织样【yàng】品对应9mL的PBS，具体体积可【kě】根据实验需【xū】要适【shì】当调整，并做【zuò】好记录。推荐在PBS中加入【rù】蛋白酶抑制【zhì】剂)加入玻璃【lí】匀浆器【qì】中，于【yú】冰上充分研磨。为了进一步裂解组织【zhī】细胞，可以对匀【yún】浆【jiāng】液进行超【chāo】声破碎，或反复冻融【róng】。后将匀【yún】浆【jiāng】液于5000×g离心5~10分钟，取【qǔ】上清【qīng】检测。

4.细【xì】胞培养物【wù】上清：请1000×g离心20分钟，取上清即【jí】可检测，或将上【shàng】清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反【fǎn】复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保存：样品收集【jí】后若在1周内进行检测的可保【bǎo】存于4℃，若【ruò】不能及时检【jiǎn】测【cè】，请按一【yī】次使用【yòng】量分【fèn】装，冻存于【yú】-20℃(1个月内检测)，或-80℃(6个月【yuè】内检【jiǎn】测)，避免反复冻【dòng】融，标【biāo】本溶血会影响后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项【xiàng】检测。

注意事项：

1.严格按照规定的时【shí】间【jiān】和温度进【jìn】行【háng】温育以保【bǎo】证准确结果。所有试剂都必须在使用【yòng】前达【dá】到室温【wēn】9-21℃。使用【yòng】后立即冷【lěng】藏保存试剂。

2.洗板不正确可【kě】以导致不准确的结果。在加入底物前【qián】确保【bǎo】尽【jìn】量吸干孔内【nèi】液【yè】体。温育过程中不要让【ràng】微孔干【gàn】燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底【dǐ】物显色液【yè】应呈无色或【huò】很浅的【de】颜【yán】色，已经变蓝的底物液不能使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反应试剂不【bú】能【néng】接【jiē】触【chù】漂白溶剂或漂白溶剂所【suǒ】散发的强烈气体【tǐ】。任何漂白成分都会破坏试剂【jì】盒【hé】中反应试剂的生物活【huó】性。

9.不能使用过期产品。

10.如【rú】果可能【néng】传播疾病，所有的样品都应管理好【hǎo】，按照规定【dìng】的程【chéng】序处理样品和检【jiǎn】测装置。

小鼠Ⅲ型前胶原(PCIII)试剂盒操作步骤：

1．从室温平衡60min后【hòu】的铝箔【bó】袋中取【qǔ】出所需【xū】板条，剩余板条用【yòng】自封袋【dài】密封放回4℃。

2．设【shè】置标准品孔和样本孔，标准品【pǐn】孔各加不同浓度的【de】标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白【bái】孔外，标准品孔和样本孔中每【měi】孔加入辣【là】根过氧化物酶(HRP)标【biāo】记的检测抗体100μL，用封板膜【mó】封【fēng】住【zhù】反应孔，37℃水浴锅或恒温箱【xiāng】温育60min。

5．弃去液体，吸【xī】水纸上【shàng】拍【pāi】干，每孔加【jiā】满洗涤液(350μL)，静置【zhì】1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗【xǐ】板5次(也可【kě】用洗板机洗【xǐ】板)。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔【kǒng】加入终止液【yè】50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的【de】OD值。

实验结果计算：

绘【huì】制标准曲线：在【zài】Excel工作表中【zhōng】，以【yǐ】标准品浓度【dù】作横坐标，对应OD值【zhí】作纵坐标，绘制出标准品线性回归【guī】曲线，按曲线方【fāng】程计算【suàn】各样本浓度值。

(此图仅供参考)

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性：板【bǎn】内变异系数【shù】小于10% ，板间变异系数小于【yú】15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避免交【jiāo】叉感染，配置不同浓度标准品【pǐn】、上样、加不【bú】同试剂都需要更换枪头。另外不【bú】同【tóng】试【shì】剂请分【fèn】别使用不同【tóng】的移液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后【hòu】的【de】显【xiǎn】色底物在上板前【qián】应为无色【sè】，请避光保存；假如微孔板后，将由物色【sè】变【biàn】成【chéng】不【bú】同深度的蓝色。

5.终止液【yè】上板顺序应同【tóng】显色底物上【shàng】板顺序一致；加入终【zhōng】止液后【hòu】，孔内颜色由【yóu】蓝【lán】变黄；若孔内有绿【lǜ】色，则表明孔内【nèi】液体未混匀；请充【chōng】分混合。

说明：

1.由于现有【yǒu】条件及【jí】科学技术水平尚不能对所有供【gòng】货商提供的【de】所有原料进行全面【miàn】的鉴定与分析，本【běn】产品可【kě】能【néng】存【cún】在一定的质量技术【shù】风险。

2.终的实验结【jié】果与试剂的有效性、实验【yàn】者的【de】相关操作以及当时【shí】的实验环境密切相关，请【qǐng】务必准备充【chōng】足的标【biāo】本备份。

3.不【bú】同批【pī】次的同一产品可能会有少【shǎo】许差别，如：检测限【xiàn】、灵【líng】敏度以及显色时间【jiān】等【děng】，请依据试【shì】剂盒【hé】内说明书进行实【shí】验操【cāo】作【zuò】，网站电子版说明书仅作参考。

4.只有全部【bù】使【shǐ】用本试【shì】剂盒配套试剂才【cái】能【néng】保证检【jiǎn】测效果，不能混用【yòng】其他商的产品【pǐn】。只有严格遵守本试剂盒的实验说明才会得到佳的检测结【jié】果【guǒ】。