本【běn】试剂盒用于体外定量检测血清、血浆【jiāng】、组织【zhī】匀浆及相关液体样本中大鼠CD4分【fèn】子(CD4)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

大鼠CD4分子(CD4)试剂盒组成：

备注：

1. (96T/48T)打开包装后请及时检【jiǎn】查【chá】所【suǒ】有物品是【shì】否齐全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大【dà】量正常标本检【jiǎn】验，标本【běn】的正常浓【nóng】度值【zhí】均在试剂盒提供的检测【cè】范围内，实验【yàn】过程中直【zhí】接取50μL样本上样即【jí】可。当【dāng】有部【bù】分样本值超过大标【biāo】准品浓度时，可用【yòng】样【yàng】本【běn】稀释液将标本进行适当稀释后【hòu】再进行实验【yàn】。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰箱中取出的浓缩洗涤液【yè】可能【néng】有结晶【jīng】，属【shǔ】于【yú】正【zhèng】常现象；放置【zhì】室温，轻摇【yáo】均【jun1】匀，待结晶【jīng】溶解后再配【pèi】置洗【xǐ】涤液。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水或【huò】去离子水稀释配【pèi】置成400ml工【gōng】作浓度的洗涤液，未用完【wán】的放回4℃

3.20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释【shì】，即【jí】1份20×洗涤缓冲【chōng】液【yè】加19份蒸馏水【shuǐ】。

实验原理：

试剂盒采【cǎi】用双抗【kàng】体一步夹【jiá】心法酶联免疫吸附【fù】试验(ELISA)。往预【yù】先包【bāo】被大鼠CD4分子【zǐ】(CD4)捕获抗体的包【bāo】被微孔中，依次加【jiā】入【rù】标本、标准【zhǔn】品【pǐn】、HRP标【biāo】记的【de】检测抗【kàng】体，经过温育并洗涤。用底物TMB显色【sè】，TMB在过氧化物酶的【de】催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的。颜色【sè】的【de】深浅和【hé】样品中的大【dà】鼠【shǔ】CD4分子(CD4)呈正相关。用【yòng】酶标仪在450nm 波【bō】长下测定吸光度(OD 值)，计【jì】算样品浓度【dù】。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪(450nm)

2.高精【jīng】度加样器及【jí】枪【qiāng】头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清：将收【shōu】集【jí】于血清分离管的【de】全血标本在室温【wēn】放置2小【xiǎo】时或4℃过夜，然【rán】后1000×g离心【xīn】20 分钟，取【qǔ】上清即可，或将上清置于-20℃或【huò】-80℃保存，但【dàn】应避免反复【fù】冻【dòng】融。

2.血浆【jiāng】：用EDTA或肝素作为抗凝【níng】剂【jì】采集标本，并将标本在采集【jí】后的30分钟内于9-21℃ 1000×g离【lí】心15分【fèn】钟，取【qǔ】上【shàng】清即【jí】可检测，或【huò】将【jiāng】上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组【zǔ】织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组【zǔ】织，去除残留血液(匀浆中裂【liè】解的【de】红细胞会影响测量结果)，称重【chóng】后将【jiāng】组织剪碎。将剪【jiǎn】碎的组织与对应体积的PBS(一般【bān】按1:9的重【chóng】量体【tǐ】积比，比【bǐ】如1g的组织样品对应【yīng】9mL的PBS，具体体积可根【gēn】据实验需【xū】要适当调整，并做好记录。推荐在【zài】PBS中加入蛋白酶【méi】抑【yì】制剂)加入玻璃匀浆器【qì】中，于冰上充【chōng】分【fèn】研磨。为【wéi】了【le】进【jìn】一步裂【liè】解组织细胞【bāo】，可以对匀浆液【yè】进行超声破碎，或反复冻融。后将【jiāng】匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检【jiǎn】测。

4.细胞培养物【wù】上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可【kě】检测，或将上【shàng】清【qīng】置【zhì】于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应避免反复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保【bǎo】存：样品收集后若在1周内【nèi】进【jìn】行检测的可保存【cún】于4℃，若不能及【jí】时【shí】检测，请按一次使用量分装【zhuāng】，冻存【cún】于-20℃(1个月【yuè】内检测)，或-80℃(6个月内【nèi】检测)，避免反复【fù】冻融，标本溶血会影响后检【jiǎn】测结果【guǒ】，因此溶血标本不【bú】宜【yí】进行此项检测。

注意事项：

1.严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准【zhǔn】确结果。所【suǒ】有试剂都必须在使【shǐ】用前达【dá】到室温【wēn】9-21℃。使用【yòng】后【hòu】立即【jí】冷藏保【bǎo】存试剂。

2.洗板不正确可以导【dǎo】致不准确的结果。在加入【rù】底【dǐ】物前【qián】确保【bǎo】尽量吸【xī】干孔内【nèi】液【yè】体【tǐ】。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物显色液应【yīng】呈无色或很浅的颜色，已经变【biàn】蓝的底物液不能【néng】使用【yòng】。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反应试剂不能【néng】接触【chù】漂白溶剂【jì】或【huò】漂白【bái】溶剂所散发【fā】的强烈气体。任何【hé】漂【piāo】白成分都会破坏试剂盒中反应试【shì】剂【jì】的生物活性。

9.不能使用过期产品。

10.如果【guǒ】可能传播疾病，所有的样品都应【yīng】管理好，按【àn】照规定的程【chéng】序处【chù】理样品和检【jiǎn】测装置。

大鼠CD4分子(CD4)试剂盒操作步骤：

1．从室温平衡60min后的铝【lǚ】箔【bó】袋中取出所需板条，剩【shèng】余【yú】板【bǎn】条用自【zì】封袋密封放【fàng】回4℃。

2．设置标准【zhǔn】品孔和样本【běn】孔，标准品孔各加不【bú】同【tóng】浓度的标【biāo】准品【pǐn】50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白【bái】孔外【wài】，标准品【pǐn】孔和样本孔中【zhōng】每孔加【jiā】入【rù】辣根【gēn】过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔【kǒng】，37℃水浴锅【guō】或【huò】恒温箱温育60min。

5．弃去液体，吸【xī】水纸上拍干，每孔【kǒng】加满洗【xǐ】涤液(350μL)，静【jìng】置1min，甩去洗涤【dí】液，吸【xī】水纸【zhǐ】上【shàng】拍干，如【rú】此重复洗板5次(也可用洗板【bǎn】机洗板)。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入终止液【yè】50μL，15min内【nèi】，在450nm波长处测定各【gè】孔的OD值【zhí】。

实验结果计算：

绘制标准曲线【xiàn】：在Excel工作【zuò】表中，以标准品浓【nóng】度作横坐标，对应OD值作纵坐【zuò】标，绘制【zhì】出【chū】标准品【pǐn】线【xiàn】性【xìng】回归曲线，按曲【qǔ】线方程计算各【gè】样本浓度值。

(此图仅供参考)

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性【xìng】：板内变异【yì】系数小于10% ，板间变异系数【shù】小【xiǎo】于【yú】15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避免【miǎn】交叉感染，配置不同浓度标准【zhǔn】品、上【shàng】样、加不同试剂都需要【yào】更换枪【qiāng】头【tóu】。另【lìng】外不同试【shì】剂请分【fèn】别使用不同的移液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后的显色底【dǐ】物在上板【bǎn】前应【yīng】为无色【sè】，请【qǐng】避光保【bǎo】存；假如微孔板后，将【jiāng】由物【wù】色变成不同深度的【de】蓝色。

5.终【zhōng】止液上板顺序应同显色【sè】底物上板顺序一致【zhì】；加【jiā】入终止液【yè】后，孔内颜色由蓝【lán】变【biàn】黄；若孔【kǒng】内有绿色，则表【biǎo】明【míng】孔【kǒng】内液体未混匀；请充分混合。

说明：

1.由于现有【yǒu】条件及科学【xué】技术水【shuǐ】平尚不【bú】能对所有供货商提供的所有原料进行【háng】全面的鉴定与分析【xī】，本产品可能存【cún】在一定【dìng】的【de】质量技术风险【xiǎn】。

2.终的【de】实验结果与【yǔ】试剂的有效性、实【shí】验【yàn】者的相关操作以及当时的实验【yàn】环境【jìng】密【mì】切相关，请务必准备充足的标本【běn】备份。

3.不同【tóng】批次的同【tóng】一产品可能会有少许差别，如：检【jiǎn】测限、灵敏【mǐn】度以及显【xiǎn】色时间等，请依据试【shì】剂盒【hé】内【nèi】说明书进行实验操作【zuò】，网站电子版说明书仅【jǐn】作【zuò】参考。

4.只有全【quán】部使用本试剂盒配【pèi】套试剂才能保【bǎo】证检测效果，不能混用其他商【shāng】的产品。只有严格遵【zūn】守本试剂盒的实验说明【míng】才会【huì】得【dé】到佳的【de】检测【cè】结果。