本试剂盒【hé】用于【yú】体外【wài】定量【liàng】检测血清、血浆【jiāng】、组织匀浆及相关液体【tǐ】样本中人Ⅲ型前胶原(PCⅢ)的【de】含量。

有效期：6个月

保存条件：9-21℃

人Ⅲ型前胶原(PCⅢ)试剂盒组成：

备注：

1. (96T/48T)打【dǎ】开包装后【hòu】请及【jí】时检查所有【yǒu】物品是否齐全。

2. 标准品浓度【dù】依次【cì】为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经【jīng】过大量正常标【biāo】本检验，标【biāo】本【běn】的【de】正常浓度【dù】值【zhí】均在试剂盒提供的检测范围内，实验【yàn】过程【chéng】中直接取【qǔ】50μL样本上样即可。当有部分样本值【zhí】超过大标准品浓【nóng】度时，可用【yòng】样【yàng】本稀释液将标本进行【háng】适当稀释后再【zài】进【jìn】行实验。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象；放置室温，轻摇均匀，待结晶溶解【jiě】后再配置【zhì】洗涤液【yè】。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去【qù】离【lí】子水稀释配【pèi】置成400ml工【gōng】作浓【nóng】度【dù】的洗涤【dí】液，未用【yòng】完【wán】的放回4℃

3.20×洗【xǐ】涤缓冲液的稀【xī】释【shì】：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗【xǐ】涤缓冲液加19份【fèn】蒸馏水。

实验原理：

试剂【jì】盒采【cǎi】用双【shuāng】抗体一步夹【jiá】心法酶联【lián】免【miǎn】疫吸附试验【yàn】(ELISA)。往预先【xiān】包被人Ⅲ型前胶原(PCⅢ)捕获抗体的包被微孔【kǒng】中，依次加入标本、标准品、HRP标【biāo】记的检测抗体【tǐ】，经过温【wēn】育并洗涤【dí】。用底物TMB显色，TMB在【zài】过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸【suān】的作用下转【zhuǎn】化成终的。颜色的【de】深【shēn】浅和【hé】样品【pǐn】中的【de】人Ⅲ型【xíng】前胶原(PCⅢ)呈【chéng】正相关【guān】。用【yòng】酶【méi】标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值)，计算样品浓度【dù】。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪(450nm)

2.高精度加样器【qì】及枪【qiāng】头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清：将收集于【yú】血清分离【lí】管的全【quán】血标本在【zài】室温放置【zhì】2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置【zhì】于-20℃或【huò】-80℃保存，但应避免反复【fù】冻融。

2.血浆：用【yòng】EDTA或肝素作为抗凝剂【jì】采集标本【běn】，并【bìng】将标本在采集【jí】后的30分钟内于9-21℃ 1000×g离心【xīn】15分钟，取上清即可检测，或【huò】将【jiāng】上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应避免反复【fù】冻融。

3.组织匀浆：用【yòng】预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲【chōng】洗组织，去除残留【liú】血液(匀浆【jiāng】中裂解的红【hóng】细胞会【huì】影响测【cè】量结【jié】果)，称重后将组【zǔ】织剪碎。将【jiāng】剪【jiǎn】碎的组【zǔ】织与对应体积的PBS(一般按1:9的重【chóng】量【liàng】体【tǐ】积比，比【bǐ】如1g的【de】组织样【yàng】品对应9mL的PBS，具体体积【jī】可根据实验需要【yào】适当【dāng】调【diào】整，并做好记【jì】录。推荐【jiàn】在PBS中加入蛋【dàn】白【bái】酶抑制剂)加【jiā】入玻璃匀浆器中，于冰【bīng】上充分研磨。为了进【jìn】一步裂解【jiě】组织细胞【bāo】，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复【fù】冻融。后将匀浆液于5000×g离心5~10分【fèn】钟，取【qǔ】上清检测。

4.细胞培养物【wù】上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检【jiǎn】测，或将上清置于【yú】-20℃或-80℃保存，但【dàn】应避免反【fǎn】复冻【dòng】融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保存：样品【pǐn】收集后若在1周内进行检测的可【kě】保存【cún】于4℃，若不能及时检测，请按一次使用【yòng】量分【fèn】装，冻存于-20℃(1个【gè】月内检测)，或【huò】-80℃(6个月内检测)，避免反复冻融【róng】，标本溶血会影响【xiǎng】后检测结【jié】果【guǒ】，因此溶【róng】血标本不宜进行【háng】此项检测。

注意事项：

1.严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确【què】结果。所【suǒ】有试剂都必【bì】须在使用前达到室【shì】温【wēn】9-21℃。使用后【hòu】立即冷【lěng】藏保存试【shì】剂。

2.洗板不正【zhèng】确【què】可以导致不准确的结果。在加入底物【wù】前确保尽量吸干【gàn】孔内【nèi】液体。温育【yù】过程【chéng】中【zhōng】不【bú】要让微孔干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底【dǐ】物【wù】显【xiǎn】色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝【lán】的底物液不能使【shǐ】用【yòng】。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反【fǎn】应试剂不【bú】能接触【chù】漂白【bái】溶剂【jì】或漂白溶剂所散发的强【qiáng】烈气体。任【rèn】何漂白成分都会【huì】破坏试【shì】剂盒中反应试剂的生物活性【xìng】。

9.不能使用过期产品。

10.如果可能传播疾病【bìng】，所有的样品都应管理【lǐ】好【hǎo】，按照规定的程【chéng】序【xù】处【chù】理样品和检测装置。

人Ⅲ型前胶原(PCⅢ)试剂盒操作步骤：

1．从室温平衡60min后的铝箔袋中取【qǔ】出【chū】所【suǒ】需板【bǎn】条，剩【shèng】余板条用自【zì】封袋密封放回4℃。

2．设置标【biāo】准品孔和样本【běn】孔，标准【zhǔn】品孔各加【jiā】不同浓度的标准品【pǐn】50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔【kǒng】外，标准品孔和样本【běn】孔中每孔加【jiā】入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用【yòng】封板膜封【fēng】住反【fǎn】应【yīng】孔，37℃水浴锅【guō】或恒【héng】温箱温育60min。

5．弃去液体，吸【xī】水纸上【shàng】拍干【gàn】，每孔加满【mǎn】洗涤液(350μL)，静置【zhì】1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重【chóng】复洗【xǐ】板5次【cì】(也可用洗板【bǎn】机洗板)。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每【měi】孔加入终【zhōng】止液【yè】50μL，15min内，在450nm波【bō】长处测定各孔的OD值【zhí】。

实验结果计算：

绘制【zhì】标准曲线【xiàn】：在Excel工【gōng】作表中，以标【biāo】准品浓度【dù】作横坐标，对应OD值作【zuò】纵【zòng】坐标，绘制出标准品线【xiàn】性回归【guī】曲线，按【àn】曲线方程计算各样【yàng】本浓度值。

(此图仅供参考)

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性：板【bǎn】内【nèi】变异系数小于10% ，板间【jiān】变异系数小【xiǎo】于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避免【miǎn】交叉感染，配置不同【tóng】浓度标准品【pǐn】、上样【yàng】、加不【bú】同试剂都【dōu】需【xū】要更换枪头。另外不【bú】同试剂请分别使【shǐ】用不同【tóng】的移液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合【hé】后的显色底【dǐ】物在上板前应为无色，请避【bì】光保存；假如微孔板【bǎn】后，将由物【wù】色变成【chéng】不同【tóng】深度【dù】的蓝色。

5.终止液上板顺序应同显色底物上板【bǎn】顺序一致【zhì】；加入终止【zhǐ】液后【hòu】，孔内颜色由【yóu】蓝变黄；若孔【kǒng】内【nèi】有绿色，则表明孔内【nèi】液体未混【hún】匀；请充分混合。

说明：

1.由于现有条【tiáo】件及科学技【jì】术水平【píng】尚不能【néng】对所有供货商【shāng】提供的【de】所有原【yuán】料进行全面的鉴定与分【fèn】析，本产品可【kě】能存在一定【dìng】的质量技术【shù】风险。

2.终【zhōng】的实验结果【guǒ】与试剂的有效性、实验者【zhě】的相【xiàng】关【guān】操作以及当时【shí】的实验环境密切相【xiàng】关，请务必【bì】准【zhǔn】备充足的标本备份。

3.不同【tóng】批次的同一产【chǎn】品可能【néng】会有少许差别，如：检测限、灵【líng】敏度以及【jí】显色时间等【děng】，请依据试剂盒内说明书进行实验【yàn】操作，网站【zhàn】电子版说明书仅【jǐn】作参考。

4.只有全部【bù】使用本【běn】试【shì】剂盒配套试剂才能保【bǎo】证检测效果，不【bú】能混用其他商的【de】产品。只有严格遵守本试【shì】剂盒的【de】实验说明才会得到佳的检测结【jié】果【guǒ】。