本试剂盒用于体【tǐ】外定【dìng】量检测血清、血浆、组织匀【yún】浆及相关【guān】液体样本中小鼠Ⅲ型胶原【yuán】(Col-Ⅲ)的【de】含量。

有效期：6个月

保存条件：9-22℃

小鼠Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)试剂盒组成：

备注：

1. (96T/48T)打【dǎ】开【kāi】包【bāo】装后请及【jí】时检查所有物品是否齐全。

2. 标准【zhǔn】品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过【guò】大量正常标【biāo】本检【jiǎn】验，标本的正常浓度值均【jun1】在试【shì】剂盒【hé】提供的检【jiǎn】测范围【wéi】内，实验过程中直接取【qǔ】50μL样【yàng】本上样即【jí】可。当有部分样本值超过大标【biāo】准品浓度时【shí】，可用样本稀释液【yè】将标本进行适当稀释后再进行实验。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰箱中【zhōng】取出的【de】浓缩洗【xǐ】涤液【yè】可能有结晶，属于正常现象；放【fàng】置室温【wēn】，轻摇均【jun1】匀，待结晶【jīng】溶解后再【zài】配置【zhì】洗涤液。可将20ml浓【nóng】缩【suō】洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释配【pèi】置成400ml工作浓度的洗涤液【yè】，未用完的【de】放【fàng】回4℃

3.20×洗涤缓【huǎn】冲液的稀释：蒸馏水【shuǐ】按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲【chōng】液加19份蒸馏【liú】水。

实验原理：

试剂盒【hé】采用【yòng】双抗体一步【bù】夹心法酶联【lián】免【miǎn】疫吸【xī】附试验(ELISA)。往预【yù】先包【bāo】被小鼠Ⅲ型胶原【yuán】(Col-Ⅲ)捕获抗体的包被微【wēi】孔中，依次加入标【biāo】本、标准品、HRP标记的检测抗体【tǐ】，经过温育并洗涤。用底物TMB显【xiǎn】色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成【chéng】蓝色，并【bìng】在酸的作用下转【zhuǎn】化成终【zhōng】的。颜色的深【shēn】浅和样品中【zhōng】的小鼠Ⅲ型胶【jiāo】原(Col-Ⅲ)呈【chéng】正相关【guān】。用【yòng】酶标仪在450nm 波长下【xià】测【cè】定吸光度(OD 值)，计算样品浓度【dù】。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪(450nm)

2.高精度【dù】加样器【qì】及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清：将收集于血清分离【lí】管的全血标本在室【shì】温放置2小【xiǎo】时或4℃过夜，然【rán】后1000×g离心【xīn】20 分钟【zhōng】，取上【shàng】清即可，或将【jiāng】上清置于-20℃或【huò】-80℃保存，但【dàn】应避免反【fǎn】复冻融。

2.血浆【jiāng】：用EDTA或肝素【sù】作为【wéi】抗凝剂采集标本，并将【jiāng】标本在采集后【hòu】的30分钟内【nèi】于9-22℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清【qīng】置于-20℃或-80℃保【bǎo】存【cún】，但应避免反复冻【dòng】融。

3.组织匀【yún】浆：用预【yù】冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液【yè】(匀【yún】浆中裂解的【de】红细胞会影【yǐng】响【xiǎng】测量结果)，称重【chóng】后将组【zǔ】织剪碎。将剪碎的【de】组织【zhī】与对应体【tǐ】积的【de】PBS(一般按【àn】1:9的重【chóng】量体【tǐ】积【jī】比【bǐ】，比如1g的组织样品对应9mL的【de】PBS，具【jù】体【tǐ】体积【jī】可根据实验需要适当调【diào】整，并做好记录。推【tuī】荐在PBS中加入蛋【dàn】白酶抑制剂)加入玻【bō】璃匀浆器中，于冰上充分【fèn】研磨。为了进一步裂【liè】解组织细胞，可以对匀浆液【yè】进行超声破碎，或反复【fù】冻融【róng】。后将匀浆【jiāng】液于5000×g离心5~10分钟【zhōng】，取上清检测。

4.细胞培【péi】养物上清【qīng】：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测【cè】，或将上【shàng】清置于【yú】-20℃或-80℃保存，但应避免【miǎn】反复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保存【cún】：样品收【shōu】集【jí】后若在1周【zhōu】内进行检测的可保存于4℃，若【ruò】不能及时检测，请按一次使用量分装【zhuāng】，冻【dòng】存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃(6个月内检测)，避【bì】免反复冻融，标本溶血【xuè】会影响【xiǎng】后检测【cè】结果【guǒ】，因此溶【róng】血标本【běn】不宜进行此项检测【cè】。

注意事项：

1.严格按照规定的【de】时间和温度进行温【wēn】育【yù】以【yǐ】保证准【zhǔn】确结果。所有试剂都必须在【zài】使用前【qián】达到室【shì】温9-22℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2.洗【xǐ】板不正确可以导致【zhì】不准确的【de】结果。在【zài】加入底【dǐ】物前确保尽量吸干孔内液【yè】体。温育【yù】过程【chéng】中不要让微孔干燥掉【diào】。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物【wù】显色【sè】液应呈【chéng】无【wú】色【sè】或很浅的颜色，已【yǐ】经变蓝的底物液不能使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反【fǎn】应试剂不【bú】能接【jiē】触【chù】漂白溶剂或漂白溶【róng】剂所散发的【de】强烈气【qì】体。任何漂白【bái】成分都会破坏试剂盒中【zhōng】反应试剂的生物【wù】活性。

9.不能使用过期产品。

10.如果可【kě】能传播疾病，所【suǒ】有的样品都应管理好，按照规定的程【chéng】序处理【lǐ】样品和【hé】检测装置。

小鼠Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)试剂盒操作步骤：

1．从室温平衡60min后【hòu】的铝箔袋中取出所【suǒ】需【xū】板条，剩余板条【tiáo】用自【zì】封袋密封放回4℃。

2．设置标【biāo】准品孔和样本孔【kǒng】，标准品孔各加不【bú】同【tóng】浓度【dù】的标【biāo】准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白【bái】孔【kǒng】外，标【biāo】准品孔和样【yàng】本孔中每孔加【jiā】入辣根过【guò】氧【yǎng】化物酶(HRP)标记的检【jiǎn】测抗体100μL，用封板膜封住反【fǎn】应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5．弃去【qù】液体，吸【xī】水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液【yè】，吸水纸上拍【pāi】干，如此重复【fù】洗板5次(也【yě】可用洗【xǐ】板机洗板)。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每【měi】孔【kǒng】加入【rù】终止【zhǐ】液50μL，15min内，在450nm波长【zhǎng】处测定各孔的OD值。

实验结果计算：

绘制标准【zhǔn】曲线：在Excel工作表中，以标【biāo】准品【pǐn】浓度作横坐标，对应OD值作纵【zòng】坐【zuò】标，绘【huì】制出标准品线性回【huí】归曲线【xiàn】，按曲线方程计算各样本浓度值【zhí】。

(此图仅供参考)

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异【yì】系数小于10% ，板间【jiān】变异【yì】系【xì】数小【xiǎo】于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避【bì】免交【jiāo】叉感【gǎn】染【rǎn】，配置不同浓【nóng】度标准品、上样、加不同试剂都需要更【gèng】换枪头。另外【wài】不同试剂【jì】请分别使用不【bú】同的移液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后【hòu】的【de】显【xiǎn】色底【dǐ】物在上板前应为【wéi】无色，请避光保存；假如微孔板后【hòu】，将由物色【sè】变成【chéng】不同深【shēn】度的蓝色。

5.终止液上【shàng】板【bǎn】顺序应【yīng】同显色【sè】底物上板顺序一致；加入终止液后【hòu】，孔内颜色由蓝变【biàn】黄；若孔内有绿色【sè】，则表明孔内液【yè】体未混【hún】匀；请充分混合。

说明：

1.由于【yú】现有条件及科学技术水【shuǐ】平【píng】尚【shàng】不能对【duì】所有供货商提供【gòng】的所有原【yuán】料进行全面【miàn】的鉴定与分析，本【běn】产品可能存在一定的质量技【jì】术风险。

2.终的【de】实验结果【guǒ】与试剂的【de】有效性、实验者的相关操作【zuò】以及当时的实验环境【jìng】密切相关，请务【wù】必准备【bèi】充足的标本备【bèi】份。

3.不同批【pī】次的同一产品可能会有少【shǎo】许差别，如：检测限、灵敏度以及显色时间等，请依据试【shì】剂盒内【nèi】说明【míng】书进【jìn】行实验【yàn】操【cāo】作，网站电子【zǐ】版说【shuō】明【míng】书仅作参考。

4.只【zhī】有全部使用本【běn】试剂【jì】盒配套试剂【jì】才能【néng】保证检测效果，不能混【hún】用其他商的产品。只有严【yán】格遵守本试剂盒的实验说明才【cái】会得【dé】到佳的检【jiǎn】测结果。