本试剂盒【hé】用【yòng】于【yú】体外定量【liàng】检【jiǎn】测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本【běn】中【zhōng】大【dà】鼠8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-22℃

大鼠8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)试剂盒组成：

备注：

1. (96T/48T)打开包【bāo】装后请【qǐng】及时检查所有物品是否齐【qí】全。

2. 标准品浓【nóng】度【dù】依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大【dà】量正常标本检验，标本的【de】正常浓度值均在【zài】试剂盒提供的检【jiǎn】测范围内，实验过程【chéng】中直接取【qǔ】50μL样本上样即【jí】可【kě】。当有部分样【yàng】本值超过大标准【zhǔn】品【pǐn】浓度时，可用样【yàng】本【běn】稀释液将【jiāng】标本进行适当稀释后再进行【háng】实验。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰箱中取【qǔ】出的浓缩洗涤液可能有结晶【jīng】，属【shǔ】于正【zhèng】常现象【xiàng】；放置室温，轻摇【yáo】均匀【yún】，待结晶溶【róng】解【jiě】后再配置【zhì】洗涤液。可将20ml浓缩洗【xǐ】涤液【yè】用【yòng】蒸馏水或去【qù】离子水稀释配置成400ml工【gōng】作【zuò】浓度的洗【xǐ】涤液，未用完的放回4℃

3.20×洗【xǐ】涤缓冲液的稀【xī】释【shì】：蒸馏水按1：20稀释，即【jí】1份20×洗【xǐ】涤缓冲液【yè】加19份蒸馏水。

实验原理：

试剂盒采用【yòng】双抗体一步夹【jiá】心法【fǎ】酶联免疫吸附【fù】试验(ELISA)。往预先【xiān】包【bāo】被大鼠8羟【qiǎng】基脱氧鸟【niǎo】苷(8-OHdG)捕【bǔ】获【huò】抗【kàng】体的包被微孔【kǒng】中，依【yī】次加入标【biāo】本、标准【zhǔn】品、HRP标记的检【jiǎn】测抗体，经过温【wēn】育【yù】并洗涤。用底物TMB显色，TMB在【zài】过【guò】氧化物酶的催【cuī】化下转化成蓝色，并在酸的作【zuò】用【yòng】下转化成终的。颜色的深【shēn】浅和样品中的大鼠8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)呈正【zhèng】相关。用酶【méi】标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值)，计算样品浓度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪(450nm)

2.高精度加样器【qì】及【jí】枪头【tóu】：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清：将收【shōu】集于血清分离管的全血标本【běn】在室温【wēn】放置2小【xiǎo】时或【huò】4℃过夜【yè】，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可【kě】，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反【fǎn】复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝【níng】剂【jì】采集标本，并将标【biāo】本在采集后的30分钟【zhōng】内于9-22℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或【huò】将上【shàng】清置于【yú】-20℃或-80℃保存，但应【yīng】避【bì】免反复冻融。

3.组织匀浆【jiāng】：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液(匀浆【jiāng】中裂解的红细胞会影响测【cè】量结【jié】果)，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对【duì】应体【tǐ】积【jī】的PBS(一般按1:9的重量体【tǐ】积比，比如1g的组织【zhī】样品【pǐn】对应9mL的PBS，具体体积【jī】可根【gēn】据实验需要适【shì】当调整，并【bìng】做好记【jì】录【lù】。推荐在PBS中加入【rù】蛋白酶抑制剂)加【jiā】入玻璃匀浆器【qì】中，于冰【bīng】上充分【fèn】研【yán】磨。为了进一步裂解组织【zhī】细胞【bāo】，可以对匀【yún】浆液进行超声【shēng】破碎，或反复冻【dòng】融。后将【jiāng】匀浆液【yè】于5000×g离心5~10分【fèn】钟，取上清检测。

4.细胞培【péi】养物上清：请1000×g离【lí】心20分钟，取上清即可检测，或将上【shàng】清置于-20℃或【huò】-80℃保存，但应避【bì】免反复冻【dòng】融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可【kě】保存【cún】于【yú】4℃，若不【bú】能及时检【jiǎn】测，请按一次使用量【liàng】分装，冻存于-20℃(1个月【yuè】内检测【cè】)，或-80℃(6个月内检【jiǎn】测)，避免反复冻融，标【biāo】本溶【róng】血【xuè】会影响后检测结果【guǒ】，因此溶血标本不【bú】宜进行此【cǐ】项检【jiǎn】测。

注意事项：

1.严【yán】格按【àn】照规定【dìng】的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试【shì】剂都必【bì】须在使用前达到室温9-22℃。使【shǐ】用【yòng】后立即冷【lěng】藏保存试剂【jì】。

2.洗【xǐ】板不正确可以导【dǎo】致不准确【què】的结果【guǒ】。在加入底物【wù】前确保尽量吸干孔内液体【tǐ】。温育【yù】过程中不要【yào】让微【wēi】孔干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物显色液应呈无色或【huò】很浅的颜色，已经变蓝的底【dǐ】物【wù】液不【bú】能使用【yòng】。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反应【yīng】试剂不能接触【chù】漂白溶剂或漂白溶剂所散【sàn】发的【de】强烈气体。任何漂【piāo】白成分【fèn】都【dōu】会破坏试剂盒中反【fǎn】应试剂的【de】生物活【huó】性。

9.不能使用过期产品。

10.如果可能传播疾病，所有的样品都应管【guǎn】理好【hǎo】，按【àn】照【zhào】规定的程序【xù】处理样品【pǐn】和【hé】检测装置。

大鼠8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)试剂盒操作步骤：

1．从室温【wēn】平衡60min后的铝箔袋中取出【chū】所需板条【tiáo】，剩余板条【tiáo】用自封【fēng】袋密封放回4℃。

2．设置标准品孔和样本孔，标准【zhǔn】品【pǐn】孔【kǒng】各加不同浓度的标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白【bái】孔外，标准品孔和【hé】样本孔中每孔加【jiā】入辣【là】根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用【yòng】封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或【huò】恒温箱温育60min。

5．弃去液体，吸水纸【zhǐ】上拍干，每【měi】孔【kǒng】加满洗涤液(350μL)，静【jìng】置1min，甩去洗涤液，吸水【shuǐ】纸上拍干，如【rú】此【cǐ】重【chóng】复洗板5次(也可用洗板【bǎn】机洗板)。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔【kǒng】加入终止液50μL，15min内【nèi】，在450nm波长处测定各【gè】孔的【de】OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工【gōng】作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标【biāo】，绘制出标准【zhǔn】品【pǐn】线【xiàn】性【xìng】回归曲线，按【àn】曲线方【fāng】程计【jì】算各样本浓度值【zhí】。

(此图仅供参考)

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复性【xìng】：板【bǎn】内变异系【xì】数【shù】小于10% ，板间变异【yì】系数小于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避免交叉感【gǎn】染，配置不同浓度【dù】标准品、上样【yàng】、加不同试剂【jì】都【dōu】需【xū】要更换枪头。另【lìng】外不同试剂【jì】请分别【bié】使用【yòng】不同的移液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后的显色底物在上板前应为【wéi】无【wú】色【sè】，请避光保存；假如微孔板后，将由物【wù】色【sè】变成【chéng】不同深度的【de】蓝色。

5.终止液【yè】上板顺序【xù】应同【tóng】显色底物上板【bǎn】顺序一【yī】致；加入终止液后【hòu】，孔内颜色由蓝变黄；若孔内有绿色，则表明孔内液【yè】体【tǐ】未混匀；请充分【fèn】混【hún】合【hé】。

说明：

1.由于现有条件及【jí】科学技术水平【píng】尚不能对所有供货商提供的【de】所有原料【liào】进行全面的鉴定与分【fèn】析，本【běn】产品【pǐn】可【kě】能存在一定的质【zhì】量技术风险。

2.终【zhōng】的实验结果【guǒ】与试剂的有效性、实验者的相关操【cāo】作【zuò】以及当时的实验【yàn】环境密切【qiē】相关，请【qǐng】务【wù】必准备充足的标本备份。

3.不同【tóng】批【pī】次的同一产品【pǐn】可能会有少许差【chà】别，如：检测限【xiàn】、灵敏度【dù】以及显色时间等，请【qǐng】依据试剂盒【hé】内说明书【shū】进行实验操作，网站电子版说明书仅【jǐn】作参考【kǎo】。

4.只有全部【bù】使用本【běn】试剂盒【hé】配套试剂【jì】才能保证检测效果，不【bú】能混用其他商的产品【pǐn】。只有【yǒu】严格遵守本试剂盒【hé】的【de】实验说明才【cái】会得【dé】到佳的检测结果。