本试剂盒用于【yú】体外定量检测血清【qīng】、血浆、组织匀浆及相关液体样【yàng】本中【zhōng】人1,4,5-三【sān】磷酸【suān】肌醇【chún】(IP3)的【de】含量。

有效期：6个月

保存条件：9-22℃

人1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)试剂盒组成：

备注：

1. (96T/48T)打开包【bāo】装【zhuāng】后请【qǐng】及时检查所有物品是否齐【qí】全。

2. 标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均【jun1】在【zài】试剂【jì】盒提供的检测【cè】范围内，实验过【guò】程中直接【jiē】取50μL样本【běn】上样即【jí】可。当有部分【fèn】样本值超过大标准【zhǔn】品浓度时，可用【yòng】样本稀释液将标本进【jìn】行适【shì】当【dāng】稀释后再进行实验。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰箱中取出的浓缩洗涤液【yè】可能有结晶，属于正常现象【xiàng】；放置室温，轻【qīng】摇均【jun1】匀【yún】，待结【jié】晶溶【róng】解后再配【pèi】置洗涤液。可【kě】将20ml浓【nóng】缩洗涤液用蒸馏水或去【qù】离子水稀释配置【zhì】成400ml工作浓度【dù】的【de】洗涤液，未用【yòng】完的放回4℃

3.20×洗涤缓冲液的稀释【shì】：蒸馏水按1：20稀释，即【jí】1份【fèn】20×洗【xǐ】涤缓冲液【yè】加19份蒸馏水。

实验原理：

试剂【jì】盒【hé】采用双【shuāng】抗体一步夹心法酶联【lián】免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被人【rén】1,4,5-三磷【lín】酸肌【jī】醇【chún】(IP3)捕获抗体的包被【bèi】微孔中，依次加【jiā】入【rù】标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤。用底物TMB显【xiǎn】色，TMB在过氧化物【wù】酶的催【cuī】化下转化成蓝色，并在【zài】酸【suān】的作用下转化成终的。颜【yán】色的深浅和样品【pǐn】中的人1,4,5-三磷【lín】酸肌醇【chún】(IP3)呈正相关【guān】。用酶【méi】标仪在450nm 波【bō】长下【xià】测定【dìng】吸【xī】光度(OD 值【zhí】)，计算样品【pǐn】浓度【dù】。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪(450nm)

2.高精度加【jiā】样器【qì】及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清【qīng】：将收集【jí】于血清分离管的全血标本在室【shì】温放置2小时或【huò】4℃过夜，然后1000×g离心20 分【fèn】钟，取上【shàng】清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保【bǎo】存，但应【yīng】避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝【gān】素作【zuò】为抗凝剂【jì】采集标本，并【bìng】将【jiāng】标本在【zài】采集【jí】后的30分钟内于9-22℃ 1000×g离心15分钟，取【qǔ】上清即可检测，或将上清置【zhì】于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融【róng】。

3.组织【zhī】匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织【zhī】，去除残留血【xuè】液(匀浆中裂解【jiě】的红细胞【bāo】会影【yǐng】响测量【liàng】结果)，称重【chóng】后将组织剪碎。将剪【jiǎn】碎的组织与对应体积的PBS(一般按【àn】1:9的【de】重量体积【jī】比，比如1g的【de】组【zǔ】织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据【jù】实验需【xū】要适当【dāng】调【diào】整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑【yì】制剂)加【jiā】入玻璃匀浆器中，于冰上充【chōng】分研【yán】磨【mó】。为【wéi】了进一步裂解【jiě】组织细胞，可【kě】以对匀浆液进行超声破碎，或反复【fù】冻融。后将匀浆【jiāng】液于5000×g离心【xīn】5~10分【fèn】钟，取上【shàng】清检【jiǎn】测。

4.细胞培养物上清：请【qǐng】1000×g离心20分钟，取【qǔ】上清即可【kě】检测，或将上清置【zhì】于【yú】-20℃或-80℃保存，但应避免反复【fù】冻【dòng】融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保存：样【yàng】品收集后若在1周【zhōu】内进【jìn】行检测的可保存于【yú】4℃，若不能及时【shí】检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测【cè】)，或-80℃(6个月内【nèi】检测)，避【bì】免【miǎn】反复冻融，标本溶血会【huì】影响后检测结果，因此【cǐ】溶【róng】血标本【běn】不宜进行此项检测【cè】。

注意事项：

1.严【yán】格【gé】按【àn】照规定的时间【jiān】和温度进行【háng】温育【yù】以保证准确结果。所有试【shì】剂都必须【xū】在【zài】使用前达到室温【wēn】9-22℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2.洗板不正确可以导致不准确的结果。在加【jiā】入【rù】底物前确保【bǎo】尽量吸干孔内液体。温【wēn】育过程中不要让微【wēi】孔干燥【zào】掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物显色【sè】液应呈无色或【huò】很【hěn】浅【qiǎn】的颜色，已经【jīng】变蓝的底物液不能使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任【rèn】何反应试剂不能接触漂白【bái】溶【róng】剂或漂白【bái】溶剂【jì】所散发的强烈气体。任【rèn】何漂【piāo】白成分都会破【pò】坏试剂盒中反应【yīng】试剂的生物活性。

9.不能使用过期产品。

10.如果可能【néng】传播疾病，所有的样品都【dōu】应【yīng】管理【lǐ】好，按照规【guī】定的程序处理样品和检测【cè】装【zhuāng】置。

人1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)试剂盒操作步骤：

1．从室温平衡【héng】60min后的【de】铝【lǚ】箔【bó】袋中取出所需板条，剩余板条用自【zì】封袋密封放回4℃。

2．设置标准品孔和样本孔，标【biāo】准品孔【kǒng】各加【jiā】不同【tóng】浓度的【de】标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，标准【zhǔn】品孔和【hé】样【yàng】本孔中每孔加入辣根过氧【yǎng】化物酶(HRP)标记的检测【cè】抗体100μL，用封板【bǎn】膜封住反【fǎn】应孔，37℃水浴【yù】锅或恒【héng】温箱温【wēn】育60min。

5．弃去液体【tǐ】，吸水纸上拍干【gàn】，每孔加满洗【xǐ】涤【dí】液(350μL)，静置1min，甩【shuǎi】去洗涤【dí】液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次【cì】(也可用洗板机洗【xǐ】板)。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入【rù】终止液50μL，15min内，在450nm波长【zhǎng】处测定各孔【kǒng】的【de】OD值。

实验结果计算：

绘制标【biāo】准曲线【xiàn】：在Excel工【gōng】作表中，以标准品【pǐn】浓度作横坐标，对应OD值作【zuò】纵坐标，绘制【zhì】出标【biāo】准【zhǔn】品线性回归曲线，按曲【qǔ】线方程计算各样本浓度【dù】值。

(此图仅供参考)

性能：

1.检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重复【fù】性：板内【nèi】变异系数小【xiǎo】于10% ，板间变异系【xì】数小于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避免【miǎn】交叉【chā】感染，配置【zhì】不同浓度标准品、上样、加不【bú】同试剂都需要更【gèng】换枪头。另外不同试剂请分别【bié】使用【yòng】不同【tóng】的移液槽【cáo】。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合【hé】后的显色底【dǐ】物在上板前应【yīng】为无色，请避光保存；假如微孔【kǒng】板后，将由物【wù】色【sè】变【biàn】成不同深度的蓝色。

5.终止【zhǐ】液【yè】上板顺序应同显【xiǎn】色底物【wù】上板顺序一致；加入终止液【yè】后，孔内颜【yán】色【sè】由蓝【lán】变黄；若孔内有绿色【sè】，则表明孔内液体未混匀；请充分混合。

说明：

1.由于现有条件【jiàn】及科学技术水平尚不能【néng】对【duì】所有供货商提供【gòng】的所有原【yuán】料进行全面的鉴定【dìng】与分【fèn】析，本产品可能存在一定的质量技术【shù】风险【xiǎn】。

2.终的实验结果与试剂的有效性【xìng】、实【shí】验者【zhě】的相关操作以【yǐ】及当时的实验环境密切相关，请【qǐng】务必准备充足【zú】的【de】标本备份【fèn】。

3.不同批次的同一【yī】产品可能会有少许差别，如：检测限、灵敏度以及【jí】显色时间【jiān】等，请依据试【shì】剂【jì】盒内说明书进行【háng】实验操作，网站电【diàn】子【zǐ】版说明书仅作【zuò】参考【kǎo】。

4.只【zhī】有全部使用本试剂盒配套试剂【jì】才【cái】能保证检测效果，不能混用【yòng】其他商的产【chǎn】品。只有严格遵守本试【shì】剂盒的实【shí】验说【shuō】明才会得到【dào】佳的检测【cè】结果。