本试【shì】剂盒用【yòng】于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相【xiàng】关【guān】液【yè】体样本中【zhōng】小鼠5-羟【qiǎng】色胺(5-HT)的含量【liàng】。

有效期：6个月

保存条件：9-22℃

小鼠5-羟色胺(5-HT)试剂盒组成：

备注：

1.(96T/48T)打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准品浓【nóng】度依次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大量正常标本检验，标本的【de】正常浓度值均在试剂盒【hé】提供的【de】检测【cè】范围内【nèi】，实验过程中直【zhí】接取50μL样本上【shàng】样即可。当有部分样本值超过大标准品【pǐn】浓度时，可用样【yàng】本稀释【shì】液将标本进行【háng】适当稀【xī】释后再进【jìn】行实验。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰箱中取出的浓【nóng】缩洗涤液可能有结晶，属于正常【cháng】现象【xiàng】；放置室温，轻摇均匀【yún】，待结晶溶解后再【zài】配【pèi】置洗【xǐ】涤液【yè】。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水【shuǐ】或【huò】去离子水稀【xī】释配置成400ml工作浓度的洗涤液，未用完的放【fàng】回4℃

3.20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏【liú】水【shuǐ】按1：20稀释，即【jí】1份20×洗涤缓冲液加【jiā】19份蒸馏水。

实验原理：

试【shì】剂【jì】盒采【cǎi】用双抗体一步【bù】夹心法酶联免疫吸附【fù】试验(ELISA)。往预先包被小鼠5-羟色胺(5-HT)捕获抗体的包被微孔中，依次【cì】加入【rù】标【biāo】本、标准品、HRP标【biāo】记的【de】检【jiǎn】测抗体【tǐ】，经过温【wēn】育并洗【xǐ】涤。用底物TMB显色，TMB在过【guò】氧化物酶【méi】的催【cuī】化下转化【huà】成蓝色，并【bìng】在酸的作用下转化成终的。颜色的深【shēn】浅和【hé】样品【pǐn】中的【de】小鼠5-羟色胺(5-HT)呈正【zhèng】相关。用酶【méi】标仪在450nm 波长下【xià】测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪(450nm)

2.高【gāo】精度加样器及枪【qiāng】头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清：将收集于血清【qīng】分离管的全血标本在室【shì】温放置2小时【shí】或4℃过【guò】夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可【kě】，或【huò】将上清置于-20℃或【huò】-80℃保【bǎo】存，但【dàn】应避免反复冻融【róng】。

2.血【xuè】浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采【cǎi】集标【biāo】本，并将【jiāng】标本【běn】在【zài】采集后的30分钟【zhōng】内【nèi】于9-22℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于【yú】-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻【dòng】融。

3.组织匀浆【jiāng】：用预冷【lěng】的【de】PBS(0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液【yè】(匀浆中裂解的红细胞会影响【xiǎng】测量结果【guǒ】)，称【chēng】重后将组织剪碎。将剪【jiǎn】碎的组织与对应体积的PBS(一【yī】般【bān】按1:9的重量【liàng】体积比，比如1g的组织样【yàng】品【pǐn】对应9mL的【de】PBS，具体体积可根【gēn】据实验需【xū】要适当调整【zhěng】，并【bìng】做好记【jì】录。推荐在PBS中加入蛋白酶【méi】抑制剂)加入玻璃匀浆器中，于冰【bīng】上充分研磨。为了进【jìn】一步裂解组织细【xì】胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。后将【jiāng】匀浆液于5000×g离心5~10分钟【zhōng】，取上清检测。

4.细【xì】胞培养物【wù】上【shàng】清：请1000×g离心20分钟，取【qǔ】上清即可检测，或将上【shàng】清置于-20℃或-80℃保存，但【dàn】应避免反复【fù】冻【dòng】融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保存：样品收集后若【ruò】在1周内【nèi】进行检测的可【kě】保存于4℃，若不能及时检测，请【qǐng】按一【yī】次使用【yòng】量分装，冻存【cún】于【yú】-20℃(1个月内检测)，或-80℃(6个【gè】月内检测)，避【bì】免反复冻融，标【biāo】本【běn】溶血会影【yǐng】响后检测结果，因此溶血【xuè】标本【běn】不宜进【jìn】行【háng】此项检测。

注意事项：

1.严格按照规定的时间和温度【dù】进行温【wēn】育以保证准确结果。所有试剂【jì】都【dōu】必须在使用前达到室温【wēn】9-22℃。使用后立即【jí】冷【lěng】藏保存【cún】试剂。

2.洗板不正确可【kě】以【yǐ】导致不准确【què】的结果。在加入【rù】底物前确保【bǎo】尽量【liàng】吸干孔内液体。温【wēn】育过程中【zhōng】不要让微孔干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物显色液【yè】应呈【chéng】无【wú】色或很浅的颜【yán】色，已经变蓝的底【dǐ】物液不【bú】能使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任【rèn】何反应试剂不【bú】能接触漂白【bái】溶剂或漂白【bái】溶【róng】剂所散发的强【qiáng】烈气体【tǐ】。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反【fǎn】应试剂的生物活【huó】性。

9.不能使用过期产品。

10.如果可能【néng】传【chuán】播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的【de】程【chéng】序【xù】处理样品和检测【cè】装置。

小鼠5-羟色胺(5-HT)试剂盒操作步骤：

1．从室温平衡【héng】60min后【hòu】的铝箔袋中取出【chū】所【suǒ】需板条，剩余板【bǎn】条用自封袋【dài】密封放回4℃。

2．设置【zhì】标【biāo】准品孔和【hé】样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，标准品孔【kǒng】和样本【běn】孔中【zhōng】每孔【kǒng】加入辣根过氧化物酶(HRP)标【biāo】记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水【shuǐ】浴【yù】锅或【huò】恒温箱温育60min。

5．弃去液【yè】体，吸水纸上拍干，每【měi】孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩【shuǎi】去洗涤液，吸水纸上拍干，如【rú】此【cǐ】重复洗【xǐ】板5次【cì】(也【yě】可用洗板【bǎn】机洗板)。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔【kǒng】加入终止【zhǐ】液【yè】50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的【de】OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲【qǔ】线：在Excel工作表中【zhōng】，以标准品浓度作【zuò】横坐标，对【duì】应OD值【zhí】作纵坐【zuò】标，绘制出标准【zhǔn】品线性回【huí】归曲【qǔ】线，按曲线【xiàn】方程计算各样本浓度值。

(此图仅供参考)

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重【chóng】复性：板内变异系【xì】数【shù】小于10% ，板间变异系数【shù】小于15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了避免交叉感【gǎn】染【rǎn】，配置不同【tóng】浓度【dù】标准品、上样、加不同【tóng】试【shì】剂都需要更换枪头【tóu】。另外不同【tóng】试剂请分别使用【yòng】不同【tóng】的移液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混【hún】合后的显色底物【wù】在上板前应为无色，请避光保【bǎo】存；假如微孔板后，将由物色变【biàn】成不同深【shēn】度【dù】的蓝色。

5.终止液上【shàng】板顺序应同【tóng】显色底物上板顺序一致；加入终止液后，孔内颜【yán】色由蓝变黄；若孔【kǒng】内【nèi】有绿【lǜ】色，则表明【míng】孔【kǒng】内【nèi】液体未混匀；请充分混合【hé】。

说明：

1.由于【yú】现有条件及科【kē】学技术水平尚【shàng】不能对所有供货商【shāng】提供的【de】所有原料进行全面的【de】鉴【jiàn】定与分【fèn】析，本【běn】产品可【kě】能存在一定的质【zhì】量技术风险。

2.终的实验结果与试【shì】剂的有效【xiào】性、实验者的相关操作以及当时【shí】的实验环境密切相关，请【qǐng】务必【bì】准备【bèi】充足的标本备【bèi】份。

3.不同批次【cì】的同一【yī】产【chǎn】品可能【néng】会有少许差别，如：检测限、灵敏度以及显【xiǎn】色【sè】时间等，请依【yī】据试剂【jì】盒【hé】内说明书进行实验操作，网站电子版说明书仅作参考。

4.只【zhī】有全部使用本试剂【jì】盒配【pèi】套试剂才能保证检测【cè】效果，不【bú】能【néng】混用其他商的产品。只有严格遵【zūn】守【shǒu】本【běn】试剂盒的实验说【shuō】明才会得到佳的检【jiǎn】测结果。