本试剂盒【hé】用于体外定量【liàng】检测血清、血浆、组织匀【yún】浆及相关液【yè】体样【yàng】本中大【dà】鼠【shǔ】5核苷酸酶(5-NT)的含量。

有效期：6个月

保存条件：9-22℃

大鼠5核苷酸酶(5-NT)试剂盒组成：

备注：

1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

2. 标准【zhǔn】品浓度【dù】依【yī】次为：800、400、200、100、50、25 pg/mL

3. 经过大【dà】量【liàng】正【zhèng】常标本检验，标本的正常【cháng】浓度值均在试剂盒提【tí】供的【de】检【jiǎn】测范围内，实验过程中直接取【qǔ】50μL样本【běn】上样即可【kě】。当有【yǒu】部分样本值超过大标准品浓度时【shí】，可用样本【běn】稀释液将标本【běn】进行适当稀释后【hòu】再进行实验【yàn】。

检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰箱中取出的【de】浓缩洗涤【dí】液可【kě】能有结晶，属于正常现象；放【fàng】置室温，轻摇均【jun1】匀，待结【jié】晶溶解【jiě】后再配【pèi】置洗涤液。可将20ml浓缩洗涤【dí】液用蒸馏水或去离子水稀释【shì】配置成400ml工【gōng】作浓度的洗涤液，未用完【wán】的放【fàng】回4℃

3.20×洗涤缓冲【chōng】液的稀释：蒸馏水按1：20稀释【shì】，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏【liú】水。

实验原理：

试剂盒采【cǎi】用双抗体一步【bù】夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠【shǔ】5核苷酸酶(5-NT)捕【bǔ】获抗【kàng】体的包被微孔中【zhōng】，依次加入标本、标准品【pǐn】、HRP标记的检测【cè】抗体，经过温育并【bìng】洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶【méi】的【de】催化下转化成蓝色，并在酸【suān】的作用下转化【huà】成终【zhōng】的。颜色的深浅【qiǎn】和样品中的大鼠【shǔ】5核苷酸【suān】酶(5-NT)呈正相关【guān】。用【yòng】酶【méi】标【biāo】仪在450nm 波长下测【cè】定吸【xī】光度（OD 值【zhí】），计算样品浓度。

实验所需自备试验器材：

1.酶标仪（450nm）

2.高精度加样器及【jí】枪【qiāng】头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1.血清【qīng】：将收【shōu】集于【yú】血清分离管的全【quán】血标本在【zài】室温放置2小【xiǎo】时或4℃过夜，然后【hòu】1000×g离心20 分钟，取上清【qīng】即可，或【huò】将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血【xuè】浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并【bìng】将标本【běn】在采集【jí】后【hòu】的30分钟内于9-22℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检【jiǎn】测，或【huò】将上清置【zhì】于【yú】-20℃或-80℃保存，但应避免反复【fù】冻【dòng】融。

3.组【zǔ】织匀浆：用预【yù】冷【lěng】的【de】PBS (0.01M, pH=7.4)冲【chōng】洗组织，去【qù】除【chú】残留血液（匀浆中【zhōng】裂解【jiě】的红细胞【bāo】会【huì】影响测量结果），称重后将【jiāng】组织剪碎。将【jiāng】剪碎的组织【zhī】与对应体积的PBS（一般【bān】按1:9的重量【liàng】体积【jī】比，比如1g的组织【zhī】样品对应9mL的PBS，具体体积【jī】可根据实验需【xū】要适【shì】当调【diào】整，并做好【hǎo】记录。推荐在PBS中加【jiā】入蛋白【bái】酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰【bīng】上充分研磨。为了进一步裂解【jiě】组织细胞【bāo】，可以对匀浆液进行超声【shēng】破碎，或反复冻融。后将匀浆液于5000×g离心5~10分【fèn】钟【zhōng】，取上清检测。

4.细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上【shàng】清即可检测，或将上清【qīng】置于【yú】-20℃或-80℃保存，但应避【bì】免反复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品【pǐn】保存：样品收集后若在1周内进【jìn】行检测的【de】可【kě】保存于4℃，若不能及时【shí】检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月【yuè】内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复【fù】冻融，标【biāo】本【běn】溶血会影响后检测结果，因此溶血标本【běn】不【bú】宜进【jìn】行【háng】此项检【jiǎn】测【cè】。

注意事项：

1.严格【gé】按照规定【dìng】的时间和温【wēn】度进行温育【yù】以保证准确结果。所【suǒ】有试剂都【dōu】必须在使用前达到室温【wēn】9-22℃。使用后立即【jí】冷藏保存试剂。

2.洗板不正确【què】可【kě】以导致不准确【què】的结果。在加入底物前确【què】保尽量吸干孔【kǒng】内液【yè】体。温育【yù】过程中不要让微孔干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.底物【wù】显色液应【yīng】呈无色或【huò】很浅的【de】颜色【sè】，已经变蓝的底物液不能使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.任何反应试剂不能接触漂白【bái】溶【róng】剂或漂白溶剂所散发的强烈【liè】气【qì】体。任何【hé】漂白成分都会【huì】破【pò】坏【huài】试剂盒【hé】中反应试剂的生物活性。

9.不能使用过期产品。

10.如果可能【néng】传播疾病【bìng】，所有【yǒu】的样品都应【yīng】管理好，按照规定的程序处【chù】理样【yàng】品和检测装【zhuāng】置。

大鼠5核苷酸酶(5-NT)试剂盒操作步骤：

1．从【cóng】室温平衡60min后的【de】铝【lǚ】箔【bó】袋中取【qǔ】出所需板条，剩余板条用自封袋密【mì】封放【fàng】回4℃。

2．设置【zhì】标准品孔和样本孔【kǒng】，标准品孔【kǒng】各加不同【tóng】浓度的标【biāo】准品50μL。

3．样本孔中a加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空【kōng】白孔外，标准品孔和样【yàng】本孔【kǒng】中每【měi】孔【kǒng】加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检【jiǎn】测抗体100μL，用封板【bǎn】膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5．弃去液体【tǐ】，吸水纸【zhǐ】上【shàng】拍干，每孔加满洗涤【dí】液（350μL），静置1min，甩去洗【xǐ】涤【dí】液，吸水纸【zhǐ】上拍干，如此重【chóng】复洗【xǐ】板5次（也可用【yòng】洗【xǐ】板机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔【kǒng】加入【rù】终止液50μL，15min内，在450nm波长处【chù】测定各孔【kǒng】的OD值。

实验结果计算：

绘制标准曲【qǔ】线【xiàn】：在Excel工作表中，以标准品浓度作【zuò】横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性【xìng】回归曲线【xiàn】，按曲线方程【chéng】计【jì】算各【gè】样【yàng】本浓度值【zhí】。

（此图仅供参考）

性能：

1. 检测范围：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2.灵敏度：检测浓度小于1.0 pg/mL。

3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.重【chóng】复性：板内变异【yì】系数【shù】小于10% ，板间变异系数小于【yú】15% 。

技术小提示：

1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

2.为了【le】避免交叉【chā】感染，配置【zhì】不同【tóng】浓【nóng】度标准品、上样、加不【bú】同试剂【jì】都需要更换枪头。另外不同试剂请分别使用不同【tóng】的【de】移液槽。

3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

4.混合后【hòu】的【de】显色底物在【zài】上板前应【yīng】为无色，请避光保存；假如微【wēi】孔板后，将由【yóu】物色变成不同深度的【de】蓝色【sè】。

5.终【zhōng】止液上板顺序【xù】应同显色底【dǐ】物上板顺序一致；加入终止液后，孔内【nèi】颜【yán】色由蓝变【biàn】黄；若孔内【nèi】有【yǒu】绿色，则表明孔内液体未混【hún】匀；请充分混【hún】合。

说明：

1.由于现有条件及【jí】科学技术【shù】水平尚不能【néng】对所有供货商提【tí】供的所有【yǒu】原料进行全面的【de】鉴定与分析，本产品可【kě】能存【cún】在一定的质量技术【shù】风【fēng】险【xiǎn】。

2.终的实验【yàn】结果与试【shì】剂的有效【xiào】性、实验者的【de】相关操【cāo】作以【yǐ】及当时的实验环境密【mì】切相关，请务必准备充足的标本备份【fèn】。

3.不同批次的同一产品可能会有少许【xǔ】差别【bié】，如【rú】：检【jiǎn】测限、灵敏度以及显色时间等，请依据试【shì】剂【jì】盒内说明书【shū】进行实验操作【zuò】，网站【zhàn】电子版说【shuō】明书仅作参考。

4.只有全部使用【yòng】本试剂【jì】盒配套试【shì】剂才能保【bǎo】证检测效果，不能混用【yòng】其他【tā】商的产品。只有严格遵【zūn】守本试剂盒的【de】实【shí】验说【shuō】明才会得到佳的【de】检测结果。