自从20世纪【jì】9-20年【nián】代问世以来，elisa法【fǎ】得到*工作者的认可及推崇，在欧美及中国【guó】获得很大【dà】的【de】推广，尤其是国【guó】内生【shēng】化领域的【de】长足发展。elisa试剂盒有着【zhe】准确性高、灵敏度【dù】高【gāo】、特【tè】异性强等很多的优点，它在检测抗体、抗原等方面【miàn】有很好【hǎo】的【de】应【yīng】用，深受广大用户朋友【yǒu】的【de】喜爱。然而，在【zài】实验过程【chéng】中，也【yě】需要注【zhù】意很多问【wèn】题，特别是显色、比色问题。

显色 

显【xiǎn】色是ELISA中的后一步温育反应，此时酶催化无【wú】色的底物有【yǒu】色的【de】产物。反【fǎn】应的温度【dù】和【hé】时间【jiān】仍是影响【xiǎng】显色的因素。在一定时间内，阴【yīn】性孔可【kě】保持无色【sè】，而阳性【xìng】孔则【zé】随时间的延长【zhǎng】而呈【chéng】色加强。适【shì】当提高温【wēn】度有助于加速显色【sè】进行。在定量测【cè】定中【zhōng】，加入底物后的反应温度【dù】和时间应按规定力【lì】求准确。定性测定的显【xiǎn】色可在室温进行，时间一般不【bú】需要严【yán】格控制，有时可【kě】根据阳性对照孔和【hé】阴性对【duì】照【zhào】孔的【de】显色【sè】适当缩【suō】短或【huò】延长反应时间，及时判断。

OPD（邻苯二胺）底物【wù】显色一般在室外温或37℃反【fǎn】应9-20分【fèn】钟后即【jí】不再加深，再延【yán】长反应【yīng】时间，可使本【běn】底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反【fǎn】应应避光进行，显色反应结束【shù】时加入终止液【yè】终止【zhǐ】反应。OPD产物用硫【liú】酸【suān】终止后，显色【sè】由橙【chéng】转【zhuǎn】向棕。

TMB（四甲基联苯胺）受光【guāng】照【zhào】的【de】影响不大，可在室温中置于操作台【tái】上，边反应观【guān】察结果。elisa试剂盒但为保【bǎo】证实验结果的稳【wěn】定性，宜在【zài】规定【dìng】的适当时间阅读结【jié】果。TMB经HRP作用后，约40分钟【zhōng】显【xiǎn】色【sè】达，随即逐渐减弱，至2小时后【hòu】即可*消退【tuì】至无色。TMB的终【zhōng】止液有多种，叠【dié】氮钠和【hé】十二烷基硫【liú】酸钠（SDS）等酶【méi】抑制剂均可【kě】使反应终止。这【zhè】类终止剂【jì】尚【shàng】能使蓝【lán】色【sè】维持较长时间（9-20小时【shí】）不褪，是【shì】目视判断【duàn】的良好终止剂。此【cǐ】外，各类酸性终止液则会使【shǐ】蓝色转变成，此时可用特定的波长【zhǎng】（450nm）测【cè】读吸光值。

比色 

比色前应先用洁净的吸水纸拭干板【bǎn】底附着【zhe】的液体，然后将板正【zhèng】确【què】放入酶标比色【sè】仪的比色架中。以软板【bǎn】为载体【tǐ】的试验，需先将板置【zhì】于【yú】标准96孔【kǒng】的座架中【zhōng】，才可【kě】进行比色。在加【jiā】底【dǐ】物液显色前，先将软板【bǎn】边缘剪净，这样，此板【bǎn】就可*平【píng】妥坐入座架中。

比【bǐ】色时应先以蒸馏水校【xiào】零点，测读底【dǐ】物孔（未经任何反【fǎn】应仅加底【dǐ】物液的孔）和空白孔（以生理【lǐ】盐水或稀释液【yè】代替【tì】标本【běn】作【zuò】全过程的【de】孔），以记录本次试验【yàn】的试剂状况。其【qí】后可用空【kōng】白【bái】孔以蒸馏【liú】水校零点【diǎn】，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然【rán】后进行【háng】计算【suàn】。

比色结【jié】果【guǒ】的表达以【yǐ】往【wǎng】通用光【guāng】密【mì】度（oplical density，OD），现按规定用吸【xī】光【guāng】度（absorbence，A），两者【zhě】含义【yì】相同。通常的表示方法是，将吸收【shōu】波长写于A字母【mǔ】的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为“A492nm”或“OD492nm”。

酶标比色仪

酶标【biāo】比【bǐ】色仪简称酶标仪，通常指于测读ELISA结【jié】果吸光度【dù】的光度计。针对固相载体形式的不同【tóng】，各有特制的适用于板【bǎn】、珠和小试【shì】管【guǎn】的设计【jì】。许多【duō】试剂公【gōng】司配套供应酶标仪【yí】。酶标仪的主要性【xìng】能指标有：测读速度【dù】、读【dú】数的准确性、重复性、度和可测范【fàn】围【wéi】、线性等等。优良的酶【méi】标仪的读【dú】数一般可【kě】到0.001，准确性【xìng】为±1%，重复性达0.5%。举例说，若某孔【kǒng】测得的A值为【wéi】1.083，则该孔相对【duì】于空气的真实A值应为1.083± 0.01(1.073～1.093)，重复测定【dìng】数次，其【qí】A值均应1.083±0.05（1.078～1.088）在之间【jiān】。酶【méi】标仪【yí】的【de】可测范围视各酶标仪【yí】的性能而不同。普通的酶标仪在0.000～2.000，新型号的酶标仪【yí】上【shàng】限【xiàn】拓宽【kuān】达【dá】2.900，甚【shèn】至更高。超出可测上限的A值常以“*”或“over”或其它【tā】符号【hào】表示【shì】。应注意可测范围与【yǔ】线性范围的不【bú】同，线性范围【wéi】常小于可测范围【wéi】，比如某一酶标【biāo】仪【yí】的可测范围为0.000～2.900，而其线性范围仅0.000～2.000，这在定量ELISA中【zhōng】制【zhì】作【zuò】标【biāo】准曲线时应予注意。

酶标【biāo】仪不应安置在【zài】阳光【guāng】或强光照射下【xià】，操作时室温宜在9-20℃，使用前先预热【rè】仪器9-20分钟，测读结果更稳定【dìng】。

测读A值时，要【yào】选用产物的敏感吸收峰，如【rú】OPD用【yòng】492nm波长。有的酶标【biāo】仪可用双【shuāng】波长【zhǎng】式测【cè】读【dú】，即每孔先后测读两【liǎng】次【cì】，次在适【shì】波【bō】长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不【bú】移动【dòng】ELISA板的位置。例【lì】如【rú】OPD用492nm为W1，630nm为W2，终【zhōng】测得的A值为两者之差（W1-W2）。双波长【zhǎng】式测【cè】读可减少由容器上的划痕或指印等【děng】造成的光干扰。

各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读elisa试剂盒说明书